苦荞来源的bHLH类转录因子、其编码基因及其应用

本发明涉及转录因子，尤其涉及从苦荞（ fagopyrum tataricum(l.) gaertn）中分离的bhlh类转录因子及其编码基因，本发明进一步涉及它们在调控黄酮类物质生物合成中的应用，属于bhlh类转录因子及其应用领域。

背景技术：

1、荞麦为蓼科(polygonaceae)荞麦属(fagopyrum)的双子叶植物，苦荞含有丰富的次生代谢产物，如黄酮类(芦丁、槲皮素和异槲皮素等)和多酚类物质。

2、目前已报道有多个转录因子参与植物黄酮代谢调控通路，如myb、bhlh和wd40等，其中bhlh类转录因子广泛参与植物类黄酮生物合成。bhlh类转录因子单独或协作调节类黄酮次生代谢生物合成途径中结构基因的表达，从而控制植物体内类黄酮的合成。

3、芦丁作为苦荞麦中极为重要的次生代谢物，它对人类健康而言具有重要意义，其具有抗菌和抗氧化特性以及降血压和降血糖功能。此外对于植物来说，芦丁可以保护植株免受太阳紫外线辐射、干燥、寒冷和害虫的伤害，因此对于芦丁合成通路中调控基因的研究是十分必要的。

技术实现思路

1、本发明目的之一是提供从苦荞分离的与黄酮类物质合成相关的bhlh类转录因子及其编码基因。

2、本发明目的之二是提供含有上述编码基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞。

3、本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于调控黄酮类类物质生物合成等方面。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

5、 为实现上述目的，本发明的一方面提供了从苦荞分离得到了bhlh类转录因子ftbhlh165，其氨基酸为（a）或（b）所示：

6、（a）、seq id no.3所示的氨基酸；或

7、（b）、将seq id no.3所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控黄酮类物质合成功能或活性的蛋白变体。

8、本发明进一步提供了该bhlh类转录因子的编码基因，其多核苷酸序列为（a）、（b）、（c）、（d）或（e）所示：

9、（a）、seq id no.1所示的多核苷酸序列；或

10、（b）、编码seq id no.3所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或

11、（c）、与seq id no.1的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有调控黄酮类物质合成功能；或

12、（d）、与seq id no.1所示的多核苷酸序列至少有90%或以上同源性的多核苷酸序列；或

13、（e）、在seq id no.1所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有调控黄酮类物质合成的功能或活性。

14、本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过dna的突变来制备bhlh转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

15、本发明还提供了转录因子ftbhlh165的编码基因的启动子，其核苷酸序列为seqid no.2所示。

16、本发明还提供了含有所述转录因子ftbhlh165的编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

17、将本发明的seq id no .1所示的编码基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。

18、将所述ftbhlh165转录因子的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、seq id no.1所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mrna切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

19、另外，本领域技术人员可以将seq id no.1所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

20、所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

21、本发明还涉及将所述的ftbhlh165转录因子的编码基因引入到植物中以调控植物黄酮类物质合成的应用，其中，所述的调控植物黄酮类物质包括促进黄酮类物质的生物合成；作为参考，所述的应用包括：（1）构建含有所述ftbhlh165转录因子的编码基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；（3）将转录因子ftbhlh165的编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

22、本发明进一步提供了一种促进植物体内黄酮类物质生物合成的方法，包括：（1）构建含有所述ftbhlh165转录因子的编码基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；（3）将所述ftbhlh165转录因子编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

23、本发明还提供了一种培育高表达黄酮类物质的植物品种的方法，包括：（1）构建含有所述编码基因、所述的嵌合基因或者所述启动子的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；（3）将所述编码基因在植物组织或细胞中进行过表达，筛选得到高表达黄酮类物质的植物品种。

24、本发明中所述的黄酮类物质包括芦丁、槲皮素或异槲皮素，优选为芦丁。

25、转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物（单子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明ftbhlh165转录因子的编码基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的ftbhlh165转录因子的编码基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的转录因子的编码基因构建体引入病毒dna或rna分子中。

26、利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株（mccormick et al.plantcell reports . 1986. 5:81-84）。 本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物，优选的，所述的目标植物包括荞麦、大豆、白三叶、苜蓿或拟南芥等，更优选为苦荞。

27、本发明从苦荞中克隆了一个新的bhlh类转录因子，将其命名为ftbhlh165；本发明利用基因工程手段，将该转录因子ftbhlh165的编码基因遗传转化荞麦外植体获得过表达的转基因荞麦毛状根； ftbhlh165基因过表达苦荞麦毛状根中芦丁含量检测结果表明，相比对照组， ftbhlh165基因过表达苦荞麦毛状根中芦丁含量显著增加，证明该转录因子调控苦荞中芦丁的生物合成，在促进苦荞中黄酮类物质的合成以及在培育或选育高产黄酮类物质苦荞麦品种中方面具有应用前景。

28、本发明所涉及到的术语定义

29、 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

30、术语“转录因子”是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类dna结合蛋白。

31、术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna（肽核酸）、在反义技术中所用的dna类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

32、术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

33、本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（tijssen, techniques  in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic probes,"overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点（tm）约5-10℃。tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、ph和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在ph 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0 m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0 m钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×ssc和1% sds，在42℃下培养；或5×ssc，1% sds，在65℃下培养，在0.2×ssc中洗涤和在65℃下于0.1% sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

34、本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

35、术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

36、术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

37、术语“转化”：将异源性dna序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

38、术语“引入”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

39、术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

40、术语“编码序列”：转录成rna的核酸序列。

41、术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的dna载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：t-dna转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性dna序列等。