一种脂肪间充质干细胞外泌体及其制备方法与应用

本发明涉及一种脂肪间充质干细胞外泌体及其制备方法与应用，尤其涉及一种通过光操控方法制备脂肪间充质干细胞外泌体、以及该脂肪间充质干细胞外泌体在修复金黄色葡萄球菌感染创伤中的应用，属于生物医学。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌（ staphylococcus aureus）是一种适应性强、传染性高的革兰氏阳性菌，可造成从浅表皮肤感染到深部脓肿等疾病甚至危及生命，严重影响人体健康。目前通常使用局部抗菌剂包括抗生素对皮肤感染创伤进行治疗和预防，但持续使用抗生素治疗成本高且副作用强，并加剧了金黄色葡萄球菌的耐药进化，因此迫切需要新的替代疗法。

2、干细胞来源外泌体是金黄色葡萄球菌感染创伤修复治疗的新策略。外泌体（exosomes）是细胞分泌、直径40~100 nm的囊泡，携带蛋白质、rnas、mirnas等，影响受体细胞的增殖、迁移等多种生理和病理进程。脂肪间充质干细胞（adipose-derivedstem cells，adscs）是来源于脂肪组织的一类能够自我更新、具有多向分化潜力的成体干细胞，具有明确的释放外泌体的特征。脂肪间充质干细胞来源外泌体一般具有调节成纤维细胞分化、促进新血管生成、下调促炎细胞因子（包括tnf-α、inos等）、上调抗炎细胞因子（il-10等）等等功能。

3、特别是对于糖尿病患者来说，异常的高血糖水平会导致创伤处炎症因子分泌过多、免疫细胞功能失调、血管生成障碍等，极易造成创伤预后不良。脂肪间充质干细胞来源外泌体通过jak/stat2信号通路促进巨噬细胞向m2型极化，也可通过pi3k/akt通路的激活促进多种细胞外基质分泌，纤维细胞增殖和迁移加快，促进组织修复和再生。然而，实现临床治疗应用的瓶颈在于如何刺激重塑干细胞，大量产出具有抑制细菌感染、高效修复再生功能、组成和功能高度均一的外泌体。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞外泌体及其制备方法与应用，尤其是一种通过光操控方法制备脂肪间充质干细胞外泌体、以及该脂肪间充质干细胞外泌体在修复金黄色葡萄球菌感染创伤修复中的应用。

2、本发明技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，包括步骤如下：

4、（1）提取分离原代脂肪间充质干细胞：取小鼠腹股沟皮下脂肪，经清洗、剪切后，置于37℃恒温气浴旋转振荡箱中，以160~200rpm恒温振荡消化25~35min，过滤后离心弃上清，将沉淀重悬、离心、洗涤后再次重悬，接入至增殖培养基中，在37℃、5%co2条件下培养6~8天，得到原代脂肪间充质干细胞；

5、（2）传代培养脂肪间充质干细胞：取步骤（1）分离的原代脂肪间充质干细胞，经清洗和消化后，加入等体积的增殖培养基混匀，离心后弃上清，将沉淀重悬混匀，接入至增殖培养基中，在37℃、5%co2条件下培养1~2天，得到传代脂肪间充质干细胞；

6、（3）特征参数蓝光刺激细胞：取步骤（2）获得的传代脂肪间充质干细胞，在光波长为455nm、光强度为4.28mw/cm2的条件下，按照1次/天用蓝光光源连续照射刺激传代脂肪间充质干细胞3天，每次60min，得到刺激后细胞；

7、（4）提取分离外泌体：收集步骤（3）获得的照射刺激后细胞的培养基上清液，过滤后通过超速离心法将外泌体分离，得到脂肪间充质干细胞外泌体。

8、根据本发明优选的，步骤（1）中，所述清洗、剪切和消化具体为：用1×pbs缓冲液冲洗小鼠腹股沟皮下脂肪2~3遍，再用无菌剪刀将脂肪剪至2×2×2 mm的小粒，接着以体积比为1：3的比例将脂肪小粒加入至0.3%的i型胶原酶/pbs消化液中，置于37℃恒温气浴旋转振荡箱中，以180rpm恒温振荡消化30min。

9、根据本发明优选的，步骤（2）中，所述清洗和消化具体为：用1×pbs缓冲液清洗原代脂肪间充质干细胞，再加入1×胰酶消化2~3min。

10、根据本发明优选的，步骤（1）和步骤（2）中，所述增殖培养基的组分如下：dmem 45ml、10%fbs 5 ml、浓度为20μg/ml的bfgf 5μl、浓度为20μg/ml的egf 5μl、浓度为20μg/ml的vegf 5μl、浓度为20μg/ml的pdgf-bb 5μl、浓度为10万u/ml的青霉素 50μl、浓度为10万u/ml的链霉素50μl。

11、根据本发明优选的，步骤（3）中，所述蓝光光源和传代脂肪间充质干细胞的距离为220mm，并在照射刺激的第2天将增殖培养基更换为无血清饥饿培养基。

12、进一步优选的，所述光源为led光板；所述无血清饥饿培养基的组分如下：dmem50ml、浓度为20μg/ml的bfgf 5μl、浓度为20μg/ml的egf 5μl、浓度为20μg/ml的vegf 5μl、浓度为20μg/ml的pdgf-bb 5μl、浓度为10万u/ml的青霉素 50μl、浓度为10万u/ml的链霉素50μl。

13、根据本发明优选的，步骤（4）中，所述超速离心法具体为：300×g离心10 min，弃沉淀，上清转移至新的洁净离心管中；2000×g离心15 min，弃沉淀，上清转移至新的洁净离心管中；10000×g离心30 min，弃沉淀，使用0.22μm滤膜过滤上清后，转移至新的洁净离心管中；100000×g离心90 min，弃上清，将沉淀使用pbs缓冲液重悬；100000×g离心90 min，弃上清，将沉淀使用pbs缓冲液重悬。

14、第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的脂肪间充质干细胞外泌体。

15、第三方面，本发明提供了上述脂肪间充质干细胞外泌体在制备修复金黄色葡萄球菌感染创伤药物中的应用。

16、本发明还提供了上述脂肪间充质干细胞外泌体在制备适用于糖尿病患者的修复金黄色葡萄球菌感染创伤药物中的应用。

17、有益效果：

18、1、本发明首次通过特征参数蓝光的照射刺激获得脂肪间充质干细胞外泌体，该方法可将脂肪间充质干细胞释放外泌体效率提高1.6倍，达到了增加脂肪间充质干细胞外泌体产量的目的。并且本发明提供的脂肪间充质干细胞外泌体制备方法不需要在干细胞中转入外源基因，不涉及病毒转染载体，不添加任何其它物质，不使用抗生素，具有广阔的临床应用前景。

19、2、本发明提供的脂肪间充质干细胞外泌体具有抑制细菌感染、高效修复再生功能，对于金黄色葡萄球菌感染后的皮肤创面愈合具有显著的促进作用。

20、3、本发明提供的脂肪间充质干细胞外泌体特别适用于糖尿病患者，针对糖尿病患者产生的金黄色葡萄球菌感染创伤，可将单位外泌体促进组织修复的效率提高1.5倍，有效解决了糖尿病患者创伤预后不良的问题，可用于制备适用于糖尿病患者的修复金黄色葡萄球菌感染创伤药物。

技术特征：

1.一种脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

2.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述清洗、剪切和消化具体为：用1×pbs缓冲液冲洗小鼠腹股沟皮下脂肪2~3遍，再用无菌剪刀将脂肪剪至2×2×2 mm的小粒，接着以体积比为1：3的比例将脂肪小粒加入至0.3%的i型胶原酶/pbs消化液中，置于37℃恒温气浴旋转振荡箱中，以180rpm恒温振荡消化30min。

3.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述清洗和消化具体为：用1×pbs缓冲液清洗原代脂肪间充质干细胞，再加入1×胰酶消化2~3min。

4.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，所述增殖培养基的组分如下：dmem 45 ml、10%fbs 5 ml、浓度为20μg/ml的bfgf5μl、浓度为20μg/ml的egf 5μl、浓度为20μg/ml的vegf 5μl、浓度为20μg/ml的pdgf-bb 5μl、浓度为10万u/ml的青霉素 50μl、浓度为10万u/ml的链霉素50μl。

5.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述蓝光光源和传代脂肪间充质干细胞的距离为220mm，并在照射刺激的第2天将增殖培养基更换为无血清饥饿培养基。

6.如权利要求5所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述蓝光光源为led光板；所述无血清饥饿培养基的组分如下：dmem 50 ml、浓度为20μg/ml的bfgf 5μl、浓度为20μg/ml的egf 5μl、浓度为20μg/ml的vegf 5μl、浓度为20μg/ml的pdgf-bb 5μl、浓度为10万u/ml的青霉素 50μl、浓度为10万u/ml的链霉素50μl。

7.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述超速离心法具体为：300×g离心10 min，弃沉淀，上清转移至新的洁净离心管中；2000×g离心15 min，弃沉淀，上清转移至新的洁净离心管中；10000×g离心30 min，弃沉淀，使用0.22μm滤膜过滤上清后，转移至新的洁净离心管中；100000×g离心90 min，弃上清，将沉淀使用pbs缓冲液重悬；100000×g离心90 min，弃上清，将沉淀使用pbs缓冲液重悬。

8.权利要求1~7任一项所述的脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法制备得到的脂肪间充质干细胞外泌体。

9.权利要求8所述的脂肪间充质干细胞外泌体在制备修复金黄色葡萄球菌感染创伤药物中的应用。

10.权利要求8所述的脂肪间充质干细胞外泌体在制备适用于糖尿病患者的修复金黄色葡萄球菌感染创伤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种脂肪间充质干细胞外泌体及其制备方法与应用，属于生物医学技术领域。包括步骤如下：（1）提取分离原代脂肪间充质干细胞；（2）传代培养脂肪间充质干细胞；（3）特征参数蓝光刺激细胞；（4）提取分离外泌体。本发明首次通过特征参数蓝光的照射刺激刺激获得脂肪间充质干细胞外泌体，该方法可将脂肪间充质干细胞释放外泌体效率提高1.6倍，达到了增加脂肪间充质干细胞外泌体产量的目的。并且本发明提供的脂肪间充质干细胞外泌体制备方法不需要在干细胞中转入外源基因，不涉及病毒转染载体，不添加任何其它物质，不使用抗生素，具有广阔的临床应用前景。

技术研发人员：李曦,任亚楠,刘奇迹,刘铎
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15