靶向PDL1的融合基因、靶向PDL1的产气细胞外囊泡及其应用

本发明涉及基因工程，特别是涉及靶向pdl1的融合基因、靶向pdl1的产气细胞外囊泡及其应用。

背景技术：

1、近年来，在肿瘤治疗方面，免疫治疗表现出令人瞩目的疗效。多项临床试验发现，抗pd1或抗pdl1单克隆抗体可以通过与pd1或pdl1结合，阻断pd1与pdl1之间的结合增强机体抗肿瘤的免疫能力，在多种难治性、复发性肿瘤患者中取得了超预期的疗效。

2、研究显示，pdl1在多种上皮肿瘤中均有上调。pdl1可以与t细胞、b细胞、树突细胞以及自然杀伤细胞上的pd1或cd80受体结合，发挥抑制t细胞增殖、减少细胞因子释放和降低细胞溶解活性的作用，从而影响肿瘤治疗效果。pdl1的表达主要受干扰素信号通路的调控，其中包括激酶jak1和jak2，转录因子stat1，stat2和stat3，以及转录激活因子irf1。干扰素γ甚至可以刺激肿瘤来源的外切体上pd-l1的表达，这也可以介导对cd8+t细胞的抑制。pdl1表达水平能够较好地反映患者对pd1或者pdl1抗体治疗的疗效；免疫组织化学(immunohistochemistry,ihc)是目前最长用的检测肿瘤的pdl1表达水平及肿瘤浸润t细胞的pd1表达水平的方法。已有临床试验结果表明ihc检测结果与患者的治疗反应相关。

3、现有组织学检测依赖于组织样本，难以实现在治疗过程中对pd1/pdl1表达水平进行动态监测；而分子影像有望提供在体实时监测。但是，现有纳米超声造影剂的靶向性、稳定性和生物相容性较差，难以实现pdl1的在体实时监测。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了靶向pdl1的融合基因、靶向pdl1的产气细胞外囊泡及其应用。利用本发明提供的靶向pdl1的融合基因表达分泌的细胞外囊泡具有良好的靶向性、稳定性和生物相容性，为实现pdl1的在体实时监测提供了技术支持。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种靶向pdl1的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。

4、本发明提供了一种融合基因的表达载体，包括上述技术方案所述的融合基因和基础载体。

5、优选的，所述基础载体包括pcdna3.1(-)载体。

6、本发明提供了一种细胞系，所述细胞系包括上述技术方案所述的表达载体和宿主细胞。

7、优选的，所述宿主细胞包括hek293t细胞。

8、本发明提供了一种靶向pdl1的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡由上述技术方案所述细胞系分泌得到。

9、本发明提供了一种靶向pdl1的产气细胞外囊泡，所述产气细胞外囊泡包括上述技术方案所述的细胞外囊泡和装载在所述细胞外囊泡内的ca(hco3)2。

10、本发明提供了上述技术方案所述产气细胞外囊泡的制备方法，包括：采用电穿孔的方法将所述ca(hco3)2装载到上述技术方案所述的细胞外囊泡内。

11、本发明提供了上述技术方案所述的融合基因或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的细胞系或上述技术方案所述的细胞外囊泡或上述技术方案所述的产气细胞外囊泡或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的产气细胞外囊泡在以下一种或多种方面中的应用，包括：制备检测pdl1表达的试剂、制备pdl1抗体、制备靶向pdl1的药用载体。

12、优选的，所述检测pdl1表达的试剂包括超声造影剂。

13、有益效果：

14、本发明提供了一种靶向pdl1的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。本发明将pd1胞外段编码序列和供体细胞转染膜蛋白(ptgfrn)编码序列连接，得到的融合基因(tpd1-ptgfrn)对pdl1具有良好的靶向性，利用本发明提供的靶向pdl1的融合基因表达分泌的细胞外囊泡是一种天然的膜性生物源性载体，具有脂质双层膜结构，具有良好的靶向性、稳定性和生物相容性，为实现pdl1的在体实时监测提供了技术支持。

15、进一步的，本发明提供的靶向pdl1的产气细胞外囊泡，通过在tpd1-ptgfrn融合基因表达分泌的细胞外囊泡内部加载ca(hco3)2，赋予其在受体细胞内产气特征，囊泡表面的pd1与p-l1结合后，被细胞内吞，由于内吞后溶酶体形成过程中ph值降低，细胞外囊泡在酸性环境中释放能与h+离子反应并释放气体的物质，实现靶细胞的胞内产气。肿瘤实质中吞噬该细胞外囊泡的量和整体pdl1表达密切相关，进而决定肿瘤中细胞产气量，通过超声对肿瘤内产气量的显像，可系统预测或评估肿瘤pdl1表达，进而对肿瘤免疫抑制状态进行评估，或监测免疫治疗效果。并且由于产气细胞外囊泡没有外壳，这种气泡在细胞内可以相互融合形成更大尺寸的气泡，通过“小到大”策略提高超声分子成像的图像质量。此外，由于产气细胞外囊泡表面的融合蛋白tpd1-ptgfrn实际上对pdl1有封闭作用，通过介导pdl1内吞和降解，在肿瘤分子超声显像的同时，可以达到免疫治疗的效果，实现细胞外囊泡对肿瘤免疫诊疗一体化的目的。

16、本发明提供的靶向pdl1的融合基因、靶向pdl1的产气细胞外囊泡可以对pdl1表达进行实时检测，对预测疗效和耐药、调整治疗方案非常有意义。

技术特征：

1.一种靶向pdl1的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种融合基因的表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的融合基因和基础载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述基础载体包括pcdna3.1(-)载体。

4.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系包括权利要求2或3所述的表达载体和宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的细胞系，其特征在于，所述宿主细胞包括hek 293t细胞。

6.一种靶向pdl1的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡由权利要求4或5所述细胞系分泌得到。

7.一种靶向pdl1的产气细胞外囊泡，其特征在于，所述产气细胞外囊泡包括权利要求6所述的细胞外囊泡和装载在所述细胞外囊泡内的ca(hco3)2。

8.权利要求7所述产气细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括：

9.权利要求1所述的融合基因或权利要求2或3所述的表达载体或权利要求4或5所述的细胞系或权利要求6所述的细胞外囊泡或权利要求7所述的产气细胞外囊泡或利用权利要求8所述制备方法制备得到的产气细胞外囊泡在以下一种或多种方面中的应用，包括：制备检测pdl1表达的试剂、制备pdl1抗体、制备靶向pdl1的药用载体。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测pdl1表达的试剂包括超声造影剂。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及靶向PDL1的融合基因、靶向PDL1的产气细胞外囊泡及其应用。本发明将PD1胞外段编码序列和供体细胞转染膜蛋白(PTGFRN)编码序列连接，得到的融合基因(tPD1‑PTGFRN)对PDL1具有良好的靶向性，利用本发明提供的靶向PDL1的融合基因表达分泌的细胞外囊泡具有良好的靶向性、稳定性和生物相容性，为实现PDL1的在体实时监测提供了技术支持。本发明提供的靶向PDL1的产气细胞外囊泡，通过在tPD1‑PTGFRN融合基因表达分泌的细胞外囊泡内部加载Ca(HCO<subgt;3</subgt;)<subgt;2</subgt;，赋予其在受体细胞内产气特征，实现细胞外囊泡对肿瘤免疫诊疗一体化的目的。

技术研发人员：袁丽君,张思妍,侯广东,梁媛
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11