一种SNAP25Ctag多肽标签系统及应用的制作方法

本发明涉及分子免疫学领域，具体涉及一种snap25c tag多肽标签以及抗该多肽标签的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、标签蛋白是与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。标签是重组蛋白纯化的一个重要且有效的工具，它们不仅便于对融合蛋白进行检测与纯化，而且可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响，包括提高重组蛋白的产量、增强重组蛋白的可溶性以及促进重组蛋白的正确折叠等，同样的，标签对于重组蛋白定量也是非常重要的，这就需要和标签蛋白抗体一起发挥作用，标签蛋白抗体是一类经过亲和纯化的抗体，用于检测各种商品化表达载体上的标签序列可以检目的蛋白的表达含量及其功能。

2、snap25基因能够编码一种突出小体相关的蛋白即snap25蛋白，其主要和中枢神经系统相关，与其共源的膜蛋白突触小泡蛋白(vamp)，质膜蛋白突触融合蛋白(syntaxin)，这三个蛋白形成突触小体相关蛋白受体(snare)。snap25进化上比较保守，含有60个保守氨基酸序列组成，总共含有206个残基，不具有跨膜段。snare由四个α-螺旋组成，其中vamp和syntaxin各提供一个α-螺旋，snap25提供两个α-螺旋，syntaxin结合在snap25n端附近，vamp结合在snap25 c端附近，在snap25 c端附近含有一段由10个亲水性氨基酸(nktrideanq)组成的多肽，并在实验中发现这段多肽具有较高的免疫源性。

3、目前市场上常用的标签系统有蛋白纯化系统，如his标签，western bloting标签系统如flag标签，免疫共沉淀标签系统如flag、ha或cmyc标签，这些标签系统被实验室广泛接受，但这些标签系统的数量还不能满足市场的需求。本发明snap25c tag是对市场上标签系统的一个很好的补充和完善，snap25c tag正如ha或cmyc标签一样，是从一个较大的蛋白质分子中发现的一个多肽肽段，本发明通过单b细胞抗体制备技术得到了特异性识别该肽段的抗体，在融合蛋白质的表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的多肽标签序列即snap25ctag，并通过单b细胞抗体制备技术得到能够特异性识别该多肽标签序列的抗体，snap25ctag序列及其对应的抗体在应用上完全可以取代现有的标签系统，如ha标签系统、flag标签系统、c-myc标签系统等，从而实现该多肽标签融合蛋白的表达检测、定位、免疫吸附和纯化等应用领域。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、一种snap25c tag多肽标签，其特征在于，所述多肽序列如seq id no.1所示。

4、snap25 c端附近有一段亲水氨基酸序列nktrideanq，这段标签(后面以snap25ctag命名)是由10个氨基酸组成的多肽，将其融合在目的蛋白的n端或者c端不会对目标蛋白的理化性质产生影响，符合标签蛋白的特性；该10个多肽序列是由亲水氨基酸序列组成，能够促进融合蛋白的表达和分泌。

5、一种抗权利要求1所述的多肽的单克隆抗体。

6、所述抗体包括11g3、7c4和2c11，所述11g3重链氨基酸序列见seq id no:2，轻链氨基酸序列见seq id no:3，11g3抗体重链三个互补区序列见seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10，11g3抗体轻链三个互补区序列见seq id no:11、seq id no:12和seq idno:13；

7、7c4重链氨基酸序列见seq id no:4和seq id no:5，7c4抗体重链三个互补区序列见seq id no:14、seq id no:15和seq id no:16，7c4抗体轻链三个互补区序列见seq idno:17、seq id no:18和seq id no:19；

8、2c11重链氨基酸序列见seq id no:6和seq id no:7，2c11抗体重链三个互补区序列见seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22，2c11抗体轻链三个互补区序列见seqid no:23、seq id no:24和seq id no:25。

9、一种用于表达所述抗体的载体。

10、一种融合蛋白，包括上述的snap25c tag多肽。

11、优选的，所述的融合蛋白为ifnα-snap25c，氨基酸序列见seq id no:26。

12、优选的，所述的融合蛋白为nploc4-snap25c，序列见seq id no:27。

13、所述的多肽在融合蛋白表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中的应用。

14、所述的抗体在融合蛋白表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中的应用。

15、所述的抗体在所述的融合蛋白表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中的应用

16、本发明发现了一个新的多肽标签，该标签由10个亲水氨基酸组成，将该多肽标签和目的蛋白融合表达后能够促进蛋白的表达且不会影响原有蛋白的性质；通过单b细胞抗体制备技术得到了特异性识别该肽段的单克隆抗体，解决一种或多种上述需求或限制，并且在一个实施方案中具体阐述了该标签系统的具体应用，所述方法包括以下步骤：

17、1)单b细胞抗体制备技术：snap25c tag是由10个多肽组成，属于半抗原，需要与钥孔血蓝蛋白(klh)或者牛血清白蛋白(bsa)偶联后组成全抗原进行免疫抗原，在本实施例中将snap25c tag的多肽序列nktrideanq合成后与klh偶联。免疫后的小鼠取出脾脏得到b细胞，利用流式细胞筛选技术得到单个snap25c tag阳性的b细胞，最终通过分子生物学手段得到抗体的重轻链序列进行重组表达。

18、2)抗snap25c tag抗体表达：基于重组蛋白表达的原理并通过哺乳动物表达系统生产重组snap25c tag单克隆抗体，该抗体的基因序列由基因公司经密码子优化合成，然后构建至高表达的真核表达载体上，如pcdna3.1瞬转载体，也可选用带有抗性基因的稳转表达载体，本实施例是构建在含有鼠igg的pcdna3.1的载体上进行顺转表达；

19、3)抗snap25c tag抗体纯化：重组表达的抗snap25c tag抗体带有fc标签，通过proteina填料进行纯化，0.1m甘氨酸(ph3.0)进行洗脱，最后用可选2m tris-hcl中和，透析液选用tris-hcl缓冲液也可以选用pbs缓冲液，适宜ph为6.0-8.0，最佳ph为7.0；

20、4)wb方法对snap25c tag融合蛋白进行定性：取5-100ng重组表达的snap25c tag融合蛋白加入等体积的loading混匀后98℃煮样10min后进行wb实验，本实施例上样量为10ng和100ng，一抗采用anti-snap25c tag antibody，按1：1000-1：10000的比值稀释anti-snap25c tag antibody一抗，37℃孵育2小时，本实施例anti-snap25c tag antibody一抗浓度为1mg/ml，稀释比值为1：5000，一抗孵育结束后继续用pbst清洗5次，二抗采用羊抗鼠-hrp；

21、5)elisa方法对snap25c tag融合蛋白进行定量：包被500ng/ml-2000ng/ml重组表达的snap25c tag融合蛋白，每孔100ul，本发明的实施例为500ng/ml，4℃包被18-24hr，第二天进行3-5次的pbst洗板；加入20-100μg/ml的anti-snap25c tag antibody，并按3倍的梯度进行倍比稀释15个孔，并设置阴性孔，即用稀释液替代抗体，37℃孵育2小时，本实施例anti-snap25c tag antibody起始是用浓度为60ug/ml。

22、6)用免疫荧光法对snap25c tag融合蛋白进行定位：将构建好的snap25c tag融合蛋白质粒转染至293t细胞中，转染48小时后吸去培养基并用pbst清洗5次，随后加入4％的多聚甲醛进行固定，常温下固定10-20min，本实施例固定14min，固定后用冰浴冷的pbs清洗5次，自然风干孔板，加入10％的血清常温下封闭30min；将anti-snap25c tag antibody按1：20-1：100进行稀释，每孔加入100ul于对应的孔中，4℃孵育过夜，本实施例anti-snap25ctag antibody的稀释比例为1：50。第二日pbst进行5次洗涤后加入羊抗鼠-fitc二抗，4℃孵育3-6小时，本实施例孵育6小时，最后进行荧光显微镜拍摄。

23、7)用亲和柱对snap25c tag融合蛋白进行纯化：将anti-snap25c tag antibody进行定向生物素标记，标记后的抗体偶联至sa磁珠上，偶联量为5-10mg/ml，本实施例偶联量为10mg/ml，偶联后的磁珠加入至snap25c tag融合蛋白表达上清中25℃下孵育30min，最后分别用nktrideanq多肽和0.1m glycine进行洗脱，通过sds-page电泳检测目的蛋白的条带。

24、本发明的有益效果在于：

25、1)snap25c tag多肽标签序列源自于人的snap25蛋白的c端，所以这个多肽标签应用于人源蛋白功能研究不会产生任何的干扰；

26、2)snap25c tag是含有10个氨基酸的亲水序列，其序列为nktrideanq，由于这些特异性，该序列符合标签序列的特征，对融合的目的蛋白不会产生功能性的干扰，并且还能够促进融合蛋白的表达；

27、3)一个合格的标签系统不仅仅是标签蛋白序列的适用性，更需要一个特异性结合该序列的抗体。本发明通过单b细胞抗体制备技术得到了抗snap25c tag的高效价的抗体，并通过实验证明了该抗体能够应用于snap25c tag融合蛋白的定位、定量、定性和纯化甚至是蛋白之间的互作实验，完全可以替代市场上常用的一些标签系统，如ha、flag、c-myc等标签系统。