一种PfuDNA聚合酶抗体组合及其应用的制作方法

本发明涉及一种pfu dna聚合酶抗体组合及其应用，属于pfu dna聚合酶。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术。它具有特异性强、灵敏℃高、快速、简便及重复性好等特点，是分子生物学研究最基础、最重要的工具之一。其原理是在dna聚合酶的催化下，以母链dna为模板，以引物为起点通过变性、退火和延伸等循环步骤，在体外对dna分子进行扩增，从而实现dna的复制。

2、pfu dna聚合酶(简称，pfu酶)是科学家从激烈火球菌(pyrococcus furiosus,pfu)分离出的一种dna聚合酶，该酶含有2个蛋白亚基(p45和p50)，为多聚体，其分子量为90kda，具有出色的热稳定性。与taqdna聚合酶不同，该酶同时具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，而3’-5’外切酶活性的主要功能是校正作用，可以即时的识别并切除错配核苷酸，这让pfu酶拥有极高的保真性。由于高保真性和高稳定性让pfu酶成为最广泛应用的dna聚合酶之一。

3、在pcr的过程中，pfu酶通常与其他dna聚合酶一样，在低温条件下，仍然具有一定聚合酶活性，从而产生非特异性扩增以及形成引物二聚体。目前可以通过很多途径以达到热启动的目的，如对酶进行基因突变、物理隔绝、化学修饰、核酸引物修饰等。但是这些方法均有不利的因素，如酶活封闭不完全、影响pcr的复杂性、影响酶的续进性、忠实性或方法比较繁琐等。

4、针对上述中的相关技术的缺点，采用单克隆抗体修饰pfu酶是一种相对更好的方法。pfu酶抗体是热启动pcr抗pfu酶的抗体，其与pfu酶结合后抑制dna聚合酶活性。在pcr扩增时，高温变性前pfu酶抗体与pfu酶结合抑制dna聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，提高扩增的特异性及目的dna产量。但是，现有的pcr中，通常只使用一种pfu dna聚合酶抗体，如果温度在70℃以上，pfudna聚合酶抗体对pfu dna聚合酶的封闭效率大幅下降，导致仍然有一些非特异性扩增。

技术实现思路

1、本发明提供了一种pfu dna聚合酶抗体组合及其应用，可以有效解决上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、一种pfu dna聚合酶抗体组合，包括pfu dna聚合酶单克隆抗体r9c8和pfu dna聚合酶单克隆抗体f10g6；所述单克隆抗体r9c8的其重链可变区序列如seq id no:7所示，其轻链可变区序列如seq id no:8所示；所述单克隆抗体f10g6的其重链可变区序列如seq idno:17所示，其轻链可变区序列如seq id no:18所示。

4、在一些实施例中，所述单克隆抗体r9c8的重链可变区序列的cdr1序列如seq idno:1所示，cdr2序列如seq id no:2所示，cdr3序列如seq id no:3所示，

5、在一些实施例中，所述单克隆抗体r9c8的轻链可变区序列的cdr1序列如seq idno:4所示，cdr2序列如seq id no:5所示，cdr3序列如seq id no:6所示。

6、在一些实施例中，所述单克隆抗体f10g6的重链可变区序列的cdr1序列如seq idno:11所示，cdr2序列如seq id no:12所示，cdr3序列如seq id no:13所示。

7、在一些实施例中，所述单克隆抗体f10g6的轻链可变区序列的cdr1序列如seq idno:14所示，cdr2序列如seq id no:15所示，cdr3序列如seq id no:16所示。

8、在一些实施例中，所述单克隆抗体r9c8的其重链序列如seq id no:9所示，其轻链序列如seq id no:10所示。

9、在一些实施例中，所述单克隆抗体f10g6的其重链序列如seq id no:19所示，其轻链序列如seq id no:20所示。

10、在一些实施例中，所述pfu dna聚合酶单克隆抗体r9c8和pfu dna聚合酶单克隆抗体f10g6的质量比为0.5-1.5：1。

11、一种上述的pfu dna聚合酶抗体组合在降低pfu dna聚合酶的非特异性扩增中的应用。

12、在一些实施例中，所述的pfu dna聚合酶抗体组合与pfu dna聚合酶的质量比为1.5-2.5：1。

13、本发明的有益效果是：

14、本发明提供了一种的pfu dna酶单克隆抗体组合，包括r9c8抗体和f10g6抗体，两者之间发挥了协同增效的作用，此组合具有较佳的在预变性阶段前的广泛的温度范围(0～70℃)内封闭pfu dna酶的5’-3’端聚合酶活性，其在70℃时封闭pfu dna聚合酶5’-3’聚合酶活性的封闭效率均97％以上，此抗体组合在用pcr中，极大的降低了非特异性扩增。

技术特征：

1.一种pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，包括pfu dna聚合酶单克隆抗体r9c8和pfu dna聚合酶单克隆抗体f10g6；所述单克隆抗体r9c8的其重链可变区序列如seq id no:7所示，其轻链可变区序列如seq id no:8所示；所述单克隆抗体f10g6的其重链可变区序列如seq id no:17所示，其轻链可变区序列如seq id no:18所示。

2.根据权利要求1所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体r9c8的重链可变区序列的cdr1序列如seq id no:1所示，cdr2序列如seq id no:2所示，cdr3序列如seq id no:3所示。

3.根据权利要求1所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体r9c8的轻链可变区序列的cdr1序列如seq id no:4所示，cdr2序列如seq id no:5所示，cdr3序列如seq id no:6所示。

4.根据权利要求1所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体f10g6的重链可变区序列的cdr1序列如seq id no:11所示，cdr2序列如seq id no:12所示，cdr3序列如seq id no:13所示。

5.根据权利要求1所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体f10g6的轻链可变区序列的cdr1序列如seq id no:14所示，cdr2序列如seq id no:15所示，cdr3序列如seq id no:16所示。

6.根据权利要求1所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体r9c8的其重链序列如seq id no:9所示，其轻链序列如seq id no:10所示。

7.根据权利要求2所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体f10g6的其重链序列如seq id no:19所示，其轻链序列如seq id no:20所示。

8.根据权利要求1所述的pfu dna聚合酶抗体组合，其特征在于，所述pfu dna聚合酶单克隆抗体r9c8和pfu dna聚合酶单克隆抗体f10g6的质量比为0.5-1.5：1。

9.一种权利要求1至8任一项所述的pfu dna聚合酶抗体组合在降低pfu dna聚合酶的非特异性扩增中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的pfu dna聚合酶抗体组合与pfudna聚合酶的质量比为1.5-2.5：1。

技术总结
本发明提供一种Pfu DNA聚合酶抗体组合，包括Pfu DNA聚合酶单克隆抗体R9C8和Pfu DNA聚合酶单克隆抗体F10G6；所述单克隆抗体R9C8的其重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；所述单克隆抗体F10G6的其重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:4所示。此组合具有较佳的在预变性阶段前的广泛的温度范围(0～70℃)内封闭Pfu DNA酶的5’‑3’端聚合酶活性。

技术研发人员：周斌,陈胜男,李旸欣,邱丽萍,赵济苍,王雅莹,姚荣星,章永垒
受保护的技术使用者：厦门康基生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11