D-泛酸生产菌株、菌剂、生产D-泛酸的方法和应用与流程

本发明属于微生物发酵生产，具体涉及一种d-泛酸生产菌株、菌剂、生产d-泛酸的方法和应用。

背景技术：

1、d泛酸(dpa)又称维生素b5，是一种普遍存在于生物体体内的必需酸性物质。它也是辅酶a生物合成的重要前体，对生物的生长有重要的促进作用。近年来，dpa因其有良好的市场前景和价值，逐渐在食品、饲料、化妆品和制药等行业得到发展和应用。

2、d泛酸的合成方法有三种：化学合成法、酶法和全生物合成法。目前，生产d泛酸的化学合成方法较为成熟，并已在工业上得到广泛应用，饲料级dpa是通过在甲醇或乙醇环境中加热dpa的两种前体(d泛解酸内酯和β丙氨酸)获得，其中d泛酸钙是最终产品。如今，泛酸的工业生产仍然主要利用化学合成方法。化学合成过程有许多局限性，比如，氢氰酸和氰化钠造成严重的环境污染和人类危害。由于日益严重的环境污染问题和日益增长的环境意识，已经开始试验使用微生物发酵工艺生产dpa，但是微生物发酵工艺生产dpa时，转化率普遍较低，难以满足工业生产的需要。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种d-泛酸生产菌株、菌剂、生产d-泛酸的方法和应用，提高转化率和效价。

2、本发明实施例提供一种d-泛酸生产菌株，所述d-泛酸生产菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m 20231938，具体为大肠杆菌escherichia coli。

3、本发明通过如下方法，筛选得到d-泛酸生产菌株，其包括以下步骤：

4、1.在湖南省常德市津市某工厂内部进行土壤采样；

5、2.通过梯度稀释法分离纯化得到多株细菌；

6、3.将多株细菌混合并使用紫外照射40s后稀释涂布在含高浓度水杨酸的lb平板，37℃培养48h；选择生长最强的菌落混合后使用紫外照射40s后稀释涂布在含有α-酮异戊酸的lb平板，37℃培养48h；经过3轮水杨酸和α-酮异戊酸的lb平板筛选最终得到系列细菌s1、s2和s3，s3经过16srna鉴定为大肠杆菌。

7、一种选育高产d-泛酸菌株的方法：

8、1.构建质粒并导入细胞：从大肠杆菌w3110中克隆出基因cyca(kegg id：jw4166，d-丝氨酸/丙氨酸/甘氨酸：h+同转运体，将β-丙氨酸转运至胞内)，并插入到载体ptrc99a上，得到质粒ptrc99a-cyca，同时将s3制备成感受态，导入ptrc99a-cyca得到细菌s3/ptrc99a-cyca；

9、2.诱变与筛选：将s3/ptrc99a-cyca菌液使用紫外照射40s后，接种到含amp和高浓度β-丙氨酸的lb摇瓶，37℃培养16h，涂布在含amp和含高浓度β-丙氨酸的lb平板，37℃培养48h；再挑取生长最旺盛的菌落诱变筛选；总共进行重复20轮诱变筛选，得到菌株d-20；

10、质粒丢失：再使用高温传代培养的方式对ptrc99a进行丢失，得到无质粒菌株，命名为xhx-dpa。

11、本发明提供一种菌剂，包括所述的d-泛酸生产菌株。

12、本发明提供一种生产d-泛酸的方法，步骤为，使用所述的d-泛酸生产菌株，通过发酵法转化原料，得到d-泛酸。

13、作为一个实施例，所述原料为葡萄糖。

14、作为一个实施例，所述发酵法转化原料的发酵培养基为一水葡萄糖15～25g/l，硫酸铵10～15g/l，磷酸氢二钾0.5～1.0g/l，七水硫酸镁0.2～0.4g/l，碳酸钙10-25g/l，酵母粉2～5g/l，β-丙氨酸2～3g/l。

15、作为一个实施例，发酵培养基中含有氨苄青霉素。

16、作为一个实施例，发酵的温度为25～37℃，搅拌转速优选为100～220rpm，发酵时间为48h，至od600为10～20，ph值为5.5～8.5，发酵结束。

17、作为一个实施例，d-泛酸生产菌株在接种前，先将d-泛酸生产菌株接种于sob培养基中，培养一段时间(37℃，220rpm条件下培养12h)后，再接种于发酵培养基中进行发酵培养(添加量为5％体积浓度)。

18、作为一个实施例，sob培养基为2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％nacl，2.5mm kcl，10mm mgcl2，10mm mgso4。

19、本发明提供一种所述的d-泛酸生产菌株的应用，用于发酵转化生产d-泛酸。

20、本发明的有益效果是，本发明设计一套完整d-泛酸筛选选育方法，并且通过运用紫外诱变、基因工程和平板筛选获得了一株具有自主知识产权的菌株。并且摇瓶产量与现有文献相比，相同摇瓶培养条件下糖酸转化率达到13.6％处于较高水平。采用该基因突变及菌种选育方法得到的菌株应用于生产d-泛酸，大大提高了d-泛酸的发酵产酸率(d泛酸/葡萄糖，g/g)，提高糖转化率，降低生产成本。

技术特征：

1.一种d-泛酸生产菌株，其特征是，所述d-泛酸生产菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m 20231938。

2.一种菌剂，其特征是，包括如权利要求1所述的d-泛酸生产菌株。

3.一种生产d-泛酸的方法，其特征是，使用如权利要求1所述的d-泛酸生产菌株，通过发酵法转化原料，得到d-泛酸。

4.如权利要求3所述的生产d-泛酸的方法，其特征是，所述原料为葡萄糖。

5.如权利要求3所述的生产d-泛酸的方法，其特征是，所述发酵法转化原料的发酵培养基为一水葡萄糖15～25g/l，硫酸铵10～15g/l，磷酸氢二钾0.5～1.0g/l，七水硫酸镁0.2～0.4g/l，碳酸钙10-25g/l，酵母粉2～5g/l，β-丙氨酸2～3g/l。

6.如权利要求3所述的生产d-泛酸的方法，其特征是，发酵培养基中含有氨苄青霉素。

7.如权利要求3所述的生产d-泛酸的方法，其特征是，发酵的温度为25～37℃。

8.如权利要求3所述的生产d-泛酸的方法，其特征是，d-泛酸生产菌株在接种前，先将d-泛酸生产菌株接种于sob培养基中，培养一段时间后，再接种于发酵培养基中进行发酵培养。

9.如权利要求8所述的生产d-泛酸的方法，其特征是，sob培养基为2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％nacl，2.5mm kcl，10mm mgcl2，10mm mgso4。

10.一种如权利要求1所述的d-泛酸生产菌株的应用，其特征是，用于发酵转化生产d-泛酸。

技术总结
本发明属于微生物发酵生产技术领域，具体涉及一种D‑泛酸生产菌株、菌剂、生产D‑泛酸的方法和应用，所述D‑泛酸生产菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M20231938，本发明菌株应用于生产D‑泛酸，大大提高了D‑泛酸的发酵产酸率，提高糖转化率，降低生产成本。

技术研发人员：张小明,谢斯思,刘喜荣,曾春玲,陈稳,杨芳
受保护的技术使用者：湖南新合新生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4