能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体及应用

本发明属于基因治疗和基因表达领域，具体能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体及应用。

背景技术：

1、bcl-2基因，即b淋巴细胞瘤-2基因，具有明显抑制细胞凋亡的作用，也是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。bcl-2蛋白家族非常庞大，按功能可分为促凋亡蛋白和抗凋亡(促存活)蛋白，前者由bh1、bh2、bh3(含有多个bh同源区域)蛋白和bh3-only(仅含bh3结构同源域)蛋白这两个亚家族组成，后者由bcl-2(含有bh1、bh2、bh3和bh4)以及它的近亲蛋白组成。相比于正常细胞，bcl-2蛋白在癌细胞中的表达高度上调，使它成为癌症治疗中的理想靶点。

2、基因突变(genic mutation)是指基因组dna分子发生的突然的、可遗传的变异现象，从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。研究表明，第60位、第70位、第87位发生突变的模拟磷酸化人bcl2蛋白可以显著增加目标重组蛋白的表达。然而，对于较大的目标重组蛋白基因(大于4.3kb，如凝血因子viii基因)，其mrna不稳定性导致表达水平较低。即使将其基因与模拟磷酸化的bcl2构建在同一表达载体中进行共表达，也无法显著增强其表达效果。

3、申请人此前的专利申请201911369828.3中披露，在小鼠bcl2t69e/s70e/s84e(人类bcl2为bcl2t69e/s70e/s87e)突变体的基础上，通过将第568位g碱基突变为t碱基，可以极大地增加较大基因重组蛋白的表达量。然而，在体内用于大基因的基因治疗方面受到限制，因为磷酸化的bcl2具有致瘤性。研究表明，小鼠bcl2的第69位苏氨酸(t)、第70位和84位丝氨酸(s)位置突变为谷氨酸(e)的bcl2t69e/s70e/s84e突变体(人类bcl2为bcl2t69e/s70e/s87e)存在诱发肿瘤的风险(wangyy等，gene therapy 2018，25(3)：220-233)。尽管在这三个位点引入丙氨酸突变(bcl2t69a/s70a/s87a)可以降低bcl2的致瘤风险，但研究发现在bcl2t69a/s70a/s87a的基础上，引入第568位g碱基(对应人类bcl2的第577位)变为t的突变并不能极大地增强其促进大基因表达的能力。

4、因此，需要探索其他途径，赋予bcl2t69a/s70a/s87a促进大基因表达的能力，以便将其应用于大基因的基因治疗。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种既能促进大于4.3kb基因表达又能极大地降低致瘤性的bcl2突变体，以使其能用于体内的大基因的基因治疗。

2、本发明提供的技术方案：

3、本发明所述能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体为在人bcl2的突变体bcl2t69a/s70a/s87a基因的第193位密码子由gga突变为终止密码子tga的基础上，第177位密码子由atg(甲硫氨酸met)突变为aag(赖氨酸lys)。

4、即在人bcl2的突变体bcl2t69a/s70a/s87a基因的第577位碱基g突变为t从而使得193位密码子由gga变为终止密码子tga的基础上，把第530碱基由野生型的t突变为a，从而使得177位密码子由atg变为aag，即可使bcl2的突变体bcl2t69a/s70a/s87a获得既促进大于4.3kb基因表达又降低致瘤性的能力。当该bcl2突变体与大于4.3kb目的基因构建于同一表达质粒共表达时，就可大大促进目的基因的表达，同时降低致瘤性。

5、人bcl2的突变体bcl2t69a/s70a/s87a由第69位的苏氨酸残基t密码子acc突变为丙氨酸残基a密码子gcg，第70位的丝氨酸残基s密码子tcg突变为丙氨酸残基a密码子gct，第87位的丝氨酸残基s密码子agc突变为丙氨酸残基a密码子gcc后得到。

6、本发明的第二个目的是提供上述能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体与目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。上述目的基因大于4.3kb。

7、作为优选，新型bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site,ires)下游，把目的基因连接在ires上游。

8、所述的大于4.3kb目的基因包括b区域删除的凝血因子viii(bdd fviii)、全长凝血因子viii(fviii)。

9、本发明的第三个目的是提供一种核酸，所述核酸编码上述能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体。

10、本发明的第四个目的是提供一种载体，所述载体包括上述核酸。

11、本发明的第五个目的是提供一种宿主细胞，其用于表达上述能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体、上述核酸和/或上述载体。

12、本发明的有益效果是：

13、本发明通过在人bcl2的突变体bcl2t69a/s70a/s87a基因的第577位碱基g突变为t从而使得193位密码子由gga变为终止密码子tga的基础上，再把第530位t碱基变为a碱基，把该经过突变的模拟去磷酸化的bcl2与目的基因构建于双顺反子的表达载体上，就可以既促进大于4.3kb的目的基因的表达又降低致瘤性，以利于在基因治疗中的应用。

技术特征：

1.一种能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体，所述bcl2突变体第69位的苏氨酸残基t密码子acc突变为丙氨酸残基a密码子gcg，第70位的丝氨酸残基s密码子tcg突变为丙氨酸残基a密码子gct，第87位的丝氨酸残基s密码子agc突变为丙氨酸残基a密码子gcc，第193位密码子由gga突变为终止密码子tga，其特征在于，所述bcl2突变体还包括第177位密码子由atg突变为aag。

2.权利要求1所述的能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体与目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述目的基因大于4.3kb。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点ires下游，把目的基因连接在ires上游。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，大于4.3kb目的基因包括b区域删除的凝血因子viii、全长凝血因子viii。

6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体。

7.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求6所述的核酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞用于表达权利要求1所述的能促进大基因表达且致瘤性低的bcl2突变体、权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的载体。

技术总结
本发明公开能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体及应用，由人Bcl2的突变体Bcl2<supgt;T69A/S70A/S87A</supgt;基因的第177位密码子由ATG突变为AAG，第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，第69位的苏氨酸残基T密码子ACC突变为丙氨酸残基A密码子GCC，第70位的丝氨酸残基S密码子TCG突变为丙氨酸残基A密码子GCT，第87位的丝氨酸残基S密码子AGC突变为丙氨酸残基A密码子GCC后得到。本发明突变体既能促进大于4.3kb基因表达又能极大地降低致瘤性，把该经过突变的模拟去磷酸化的Bcl2与目的基因构建于双顺反子的表达载体上，有利于在基因治疗中的应用。

技术研发人员：王彦刈
受保护的技术使用者：杭州电子科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4