一种靶向敲除WNT5A基因的质粒及其制备方法与应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种靶向敲除wnt5a基因的质粒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、基因编辑技术是人们开启认识基因功能的钥匙，随着人类基因组计划的完成，将已知基因的序列与功能联系在一起的功能基因组学研究成为后基因组时代的一大研究热点。crispr/cas9系统是由cas9核酸酶和特异的sgrna构成的新型靶向基因组编辑技术。以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势，有望成为被广泛应用的基本分子操纵技术，将对生物学的基础研究与应用产生深远的影响。

2、crispr/cas9系统被视为一种高效的基因编辑技术，并已广泛应用于针对不同生物基因组特定基因的靶向编辑。人类wnt5a基因位于3p14 p21染色体上。研究发现，wnt5a在癌症发生发展中具有重要作用，而尚未有针对于wnt5a基因的靶向基因敲除的构建技术，从而阻碍了当前人们对wnt5a基因在人类中具体功能的理解、研究及医疗领域的开发应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向敲除wnt5a基因的质粒及其制备方法与应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种靶向敲除wnt5a基因的sgrna，所述sgrna基于crispr/cas9基因编辑技术，能够靶向wnt5a基因cds区外显子，并敲除wnt5a基因。本申请发明人设计了针对wnt5a基因编码区处于开放读码框(cds)的外显子序列exon3(ense00001032709)的sgrna：agtatcaattccgacatcga，该sgrna能够能有效靶向wnt5a基因。

3、作为本发明所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna的优选实施方式，所述外显子为wnt5a基因的第三个外显子。

4、作为本发明所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna的优选实施方式，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、作为本发明所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna的优选实施方式，所述sgrna的双链dna模板序列如seq id no:2和seq id no:3所示。所述seq id no:2具体为：caccgagtatcaattccgacatcga；seq id no:3具体为：aaactcgatgtcggaattgatactc。

6、本发明还提供一种靶向敲除wnt5a基因的质粒，包括所述的sgrna。

7、本发明还提供所述靶向敲除wnt5a基因的质粒的构建方法，包括以下步骤：

8、(1)针对sgrna设计sgrna正反链，经退火形成双链dna；

9、(2)将双链dna与px459v2载体连接，构建获得靶向敲除wnt5a基因的质粒。

10、本发明还提供一种敲除肝癌细胞wnt5a基因的方法，将所述的质粒转染入肝癌细胞中，得敲除wnt5a基因的肝癌细胞。

11、更优选地，所述肝癌细胞为肝癌pp5细胞。

12、本发明还提供所述的敲除肝癌细胞wnt5a基因的方法构建得到的敲除wnt5a基因的肝癌细胞。

13、本发明还提供所述靶向敲除wnt5a基因的sgrna或所述靶向敲除wnt5a基因的质粒在制备治疗癌症的药物中的应用。

14、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述癌症包括肝癌。

15、本发明的有益效果：本发明提供一种靶向敲除wnt5a基因的质粒及其制备方法与应用。本发明构建了针对人类基因组序列中的wnt5a基因敲除质粒，该质粒能够有效的对wnt5a基因进行靶向敲除；本发明基于crispr/cas9技术对wnt5a基因进行敲除，实验流程简单，成功率高，成本低；本发明成功构建了敲除wnt5a基因的肝癌细胞，为探索肝癌等肿瘤发生发展分子机制提供了有效的研究平台，为肿瘤的精准防治提供新型研究模型。

技术特征：

1.一种靶向敲除wnt5a基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna基于crispr/cas9基因编辑技术，能够靶向wnt5a基因cds区外显子，并敲除wnt5a基因。

2.根据权利要求1所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna，其特征在于，所述外显子为wnt5a基因的第三个外显子。

3.根据权利要求1所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4.根据权利要求3所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的双链dna模板序列如seq id no:2和seq id no:3所示。

5.一种靶向敲除wnt5a基因的质粒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的sgrna。

6.根据权利要求5所述靶向敲除wnt5a基因的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.一种敲除肝癌细胞wnt5a基因的方法，其特征在于，将权利要求5所述的质粒转染入肝癌细胞中，得敲除wnt5a基因的肝癌细胞。

8.权利要求7所述的敲除肝癌细胞wnt5a基因的方法构建得到的敲除wnt5a基因的肝癌细胞。

9.权利要求1所述的靶向敲除wnt5a基因的sgrna或权利要求5所述靶向敲除wnt5a基因的质粒在制备治疗癌症的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症包括肝癌。

技术总结
本发明公开了一种靶向敲除WNT5A基因的质粒及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向敲除WNT5A基因的sgRNA，所述sgRNA基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，能够靶向WNT5A基因CDS区外显子，并敲除WNT5A基因。本发明构建了针对人类基因组序列中的WNT5A基因敲除质粒，该质粒能够有效的对WNT5A基因进行靶向敲除；本发明基于CRISPR/CAS9技术对WNT5A基因进行敲除，实验流程简单，成功率高，成本低；本发明成功构建了敲除WNT5A基因的肝癌细胞，为探索肝癌等肿瘤发生发展分子机制提供了有效的研究平台，为肿瘤的精准防治提供新型研究模型。

技术研发人员：甘晓宁
受保护的技术使用者：广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4