一种前列腺炎特异性检测抗体制备方法及应用与流程

本发明涉及诊断原料开发，特别涉及一种前列腺炎特异性检测抗体制备方法及应用。

背景技术：

1、前列腺炎是指前列腺组织的炎症，是男性常见的泌尿系统疾病之一。前列腺是男性生殖系统的一个重要器官，位于膀胱的下方，包绕着输尿管。前列腺炎可以分为急性前列腺炎和慢性前列腺炎两种类型。急性前列腺炎通常由细菌感染引起，症状包括腰痛、盆腔痛、尿频、尿急、尿痛等。慢性前列腺炎则是一种长期存在的炎症，症状可以轻微或反复出现，影响生活质量。据报道前列腺炎在男性中发病率约8％，前列腺炎的发病原因多种多样，包括细菌感染、病毒感染、真菌感染、尿液逆流等。其他因素，如长时间坐着、缺乏运动、过度使用尿频和尿急药物等，也可能增加前列腺炎的风险。

2、虽然前列腺炎在男性中非常常见，但通过适当的治疗和保持良好的生活习惯，可以减少炎症的发生和复发。定期体检和注意个人卫生也是预防前列腺炎的重要措施。目前，主要的前列腺诊断方法包括前列腺指检、psa血液检测、经直肠超声检查等。然而，这些方法存在一定的局限性。前列腺指检的主观性和不适应性限制了其在早期诊断中的应用；psa血液检测存在假阳性和假阴性结果的可能性；经直肠超声检查在准确性和无创性方面对患者有侵入性，检测体验较差。尚缺乏一种准确、无创、敏感和特异的方法来早期诊断前列腺炎症。早期诊断对于提高治疗效果和预后至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种前列腺炎特异性检测抗体制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种前列腺炎特异性检测抗体制备方法，所述制备方法包括以下几个步骤：

3、第一步，进行前列腺炎确诊患者尿液蛋白的提取，所述提取的操作包括随机尿样本的收集、尿液样本的预冷、过夜透析、离心过滤和离心浓缩，最终获得前列腺炎尿液蛋白，然后使用相同方法获取健康者的尿液蛋白进行抗体筛选；

4、第二步，使用抗原蛋白进行小鼠免疫，所述免疫的操作先进行初次免疫，初次免疫每隔14d之后进行多次免疫，且在免疫过程中间接elisa测定小鼠血清抗体效价，当效价达到243000倍稀释度，小鼠腹腔注射50μg前列腺炎尿液蛋白加强免疫4天后采集脾脏；

5、第三步，构建噬菌体抗体文库，将第二步采集的脾脏碾压成粉末状，之后制备获取脾脏总rna，然后再进行rna的反转录，并对反转录的cdna作为模板进行抗体重轻链可变区基因扩增，然后将扩增获得的抗体酶切消化后使用t4连接酶进行过夜连接，最后制备浓缩文库；

6、第四步，进行前列腺炎确诊患者尿液蛋白特异性抗体筛选，首先是将前列腺炎确诊患者尿液蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，然后按照每孔100μl加入酶标板中，于4℃过夜放置，次日取出，扣干孔内液体，加入pbst洗液洗两遍扣干，随后加入2％bsa溶液进行室温封闭1小时，用pbst洗液再次洗两次扣干；

7、之后再加入2.00e+12的浓缩文库，37℃孵育1小时后，吸出文库转移到预包被前列腺炎确诊患者尿液蛋白的包被板中继续37℃孵育1小时，进行文库四轮筛选后，从文库筛选感染的平皿中挑选单克隆，通过淘洗筛选出包括m001、m002、m003和m004四株克隆，最后对m001株进行测序；

8、第五步，进行anti-psps-m001抗体表达及活性检测，将测序获得m001克隆序列构建哺乳动物细胞表达载体，在轻链融合小鼠kappa链恒定区，在重链端引入小鼠igg2a完整核定区，且质粒使用pei转染试剂转染293f细胞并发酵，6天后进行收料，上清液使用protein g柱亲和纯化获得anti-psps-m001抗体。

9、优选的，所述第一步的尿液蛋白的提取操作中预冷是向采集到的尿样本中加入蛋白酶抑制剂并放入4℃孵育箱中预冷两小时；

10、所述第一步中的过夜透析是将预冷的尿样本，放入在4℃预冷的ph＝7.3的pbs缓冲液中，使用孔径3kd的透析袋进行过夜透析。

11、优选的，所述第一步中离心过滤分为两次离心和真空抽滤，第一次是离心将透析后的尿样本在温度为4℃，11000rpm离心15分钟后去沉淀，第二次离心是取第一次离心的上清液，继续在4℃环境下11000rpm离心15分钟去沉淀，最后取第二次离心的上清液，在4℃环境下使用0.22um亲水滤膜进行真空抽滤。

12、优选的，所述第一步中离心浓缩是，取离心过滤后的样品，使用5kd的超滤管，在4℃环境下4000rpm离心浓缩。

13、优选的，所述第三步中制备脾脏总rna的操作包括以下几个步骤：

14、s1，首先取研磨的脾脏粉末加入trizol中充分混匀，并用匀浆机打碎来回打碎；

15、s2，将打碎后的脾脏粉末在室温下静置5min后，每个样品取1ml依次分别加入ep管中，且进一步地加氯仿到ep管中，并盖紧样品管盖；

16、s3，摇晃试管后静置5min，取上层得到680-750μl的上清液；

17、s4，向s3中得到的上清液中加入等体积的异丙醇，混合完成之后在室温下静置20—30min；

18、s5，将s4中得到的样品以11000rpm，在4℃下离心10min，然后弃上清，并加入700μl75％乙醇，洗涤沉淀二次；

19、s6，将s5中得到的样品在4℃下，以7000rpm离心5min，然后弃上清，室温晾干，加入depc水完全溶解，得到脾脏总rna。

20、优选的，所述第三步中rna的反转录是提取的总rna使用微量分光光度计定量后，以50μl反转录体系进行反转录；

21、所述rna的反转录的条件是94℃预变性2min，94℃、30s，55℃、30s和72℃、30s，72℃充分延伸5min，并进行30个循环。

22、优选的，所述第三步中浓缩文库制备的浓缩方法是加入4％ peg8000和3％nacl，混匀后冰浴1小时，之后4℃，13000g离心40分钟，去除上清，加入浓缩前总体积5％的pbs无菌缓冲液进行溶解得到浓缩文库，之后将得到的浓缩文库使用梯度稀释法稀释后，感染xl1-blue计算浓度，最终计算得到浓度为8.13e+12cfu/ml的文库浓度。

23、优选的，所述第四步中文库筛选是在浓缩文库孵育完成后扣除文库，使用pbst缓冲液洗板8次，拍干酶标板并加入甘氨酸洗脱液洗脱结合的噬菌体，加入tris缓冲液调节ph值为中性，之后将上述洗脱液与大肠杆菌混合，37℃孵育30min后震荡培养，最后加入vcsm13辅助噬菌体拯救后在30℃条件下震荡培养过夜得到筛选文库，且筛选四轮。

24、优选的，所述第四步中单克隆挑选完成之后，包被前列腺炎尿液蛋白，同时包被健康者的尿液蛋白作为检测对照，4℃过夜后，再通过2％bsa封闭后加入噬菌体表达上清室温孵育1小时后洗板，之后加入anti-m13二抗继续室温孵育1小时后洗板，接着加入tmb显色底物，最后室温显色15分钟，加入显色终止液，终止显色反应，并在450nm下进行吸光度检测。

25、一种前列腺炎特异性检测抗体的应用，该特异性检测抗体用于识别前列腺炎症患者与健康人尿液中特异性差异蛋白，并用于提供前列腺炎诊断的原料。

26、本发明的技术效果和优点：

27、本发明开发了一种前列腺炎症特异性检测抗体制备技术，制备步骤包括抗原前列腺炎尿液蛋白的制备、动物免疫策略、抗体文库筛选以及抗体生产和验证等相关流程和数据，通过此方法获得了一种特异性识别前列腺炎患者尿液蛋白的抗体，为anti-psps-m001抗体，该抗体具有优异的抗体稳定性和抗原识别特异性，在有限的样本检测过程中其成功检测出了前列腺炎症尿液蛋白与健康人尿液蛋白之间的信号差异，本发明所开发的方法能够成功制备出具有诊断价值的前列腺炎原料。