一种大量合成天然环二鸟苷酸的基因工程菌及其应用

：本发明属于生物技术、生物工程领域，具体涉及一种大量合成天然环二鸟苷酸的基因工程菌及其应用。

背景技术：

1、环二鸟苷酸(cyclicdi-gmp，c-di-gmp)是细菌中普遍存在的第二信使分子，在细菌运动与定殖、细胞分化、生物被膜形成、致病因子产生以及细胞间通讯等方面发挥重要作用。研究发现c-di-gmp具有强大的免疫刺激特性，作用于真核细胞可以产生很好的免疫调节作用。c-di-gmp可以结合固有免疫相关蛋白sting(干扰素基因刺激因子)并诱导其发生构象变化与空间位移，进而激活下游信号通路完成i型干扰素和促炎细胞因子的诱导表达，从而激活固有免疫应答。因此，c-di-gmp可用于制备sting激动剂或免疫佐剂，或者制备治疗与sting蛋白功能相关疾病的药物。随着免疫治疗领域的迅速发展，利用环二核苷酸类sting激动剂来调sting信号通路已成为免疫治疗的新途径，天然环二核苷酸及其类似物的合成由于其重要应用价值也成为近年来的研究热点。

2、目前，c-di-gmp主要通过化学法与酶法合成。化学合成法存在耗时长、步骤多且不环保等缺陷，而酶合成法则需要高成本的gtp底物和纯酶，因此目前市售的c-di-gmp价格仍然非常昂贵，高达3000-4000元/mg(以默克有限公司销售价格为例)。而利用细菌体内的c-di-gmp合成与降解通路是生产天然c-di-gmp的另一种选择。细菌体内的c-di-gmp合成与降解代谢分别受二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶调控，二鸟苷酸环化酶的活性中心为ggdef结构域，催化2分子gtp合成一分子c-di-gmp；磷酸二酯酶的活性中心为eal或hd-gyp结构域，分别将c-di-gmp降解为pgpg或gmp。然而，细菌体内的c-di-gmp浓度受控于合成酶与降解酶之间的相互作用及其与其他蛋白之间相互作用，是一个复杂而精细的调控网络。在主磷酸二酯酶的作用下，胞内c-di-gmp维持在一个极低的水平。而且二鸟苷酸环化酶合成反应过程也会受到c-di-gmp自身的反馈抑制，由ggdef结构域中的活性抑制位点rxxd结合c-di-gmp而发生抑制效应，使得胞内c-di-gmp合成具有一定的浓度上限。因此，如果采用传统的基因表达方法，在野生细菌体内往往无法实现天然c-di-gmp的高产量。

3、本发明旨在通过理性设计与改造鞘氨醇菌体内的c-di-gmp合成与降解通路以及主二鸟苷酸环化酶的活性抑制位点，从而构建一种大量合成天然c-di-gmp的基因工程菌，为业内提供一种绿色、简单、经济、高效的天然c-di-gmp生产方法，为制备sting激动剂或免疫佐剂、或者制备治疗与sting蛋白功能相关疾病的药物提供一种质优价廉的原材料。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供在c2菌株细胞内行使c-di-gmp降解功能具有决定性作用的主磷酸二酯酶基因chr1_233。

2、所述的主磷酸二酯酶基因chr1_233的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的第二个目的是提供敲除鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum中的主磷酸二酯酶基因chr1_233在提高菌株胞内合成c-di-gmp中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体，主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457的核苷酸序列如seq id no.3所示，突变体的核苷酸序列如seqid no.6所示。

5、本发明的第四个目的是在鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum中超表达主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体在提高菌株胞内合成c-di-gmp中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供启动子tf962，其核苷酸序列如seq id no.5所示。

7、本发明的第六个目的是提供利用启动子tf962启动主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457在鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum中超表达主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体在提高菌株胞内合成c-di-gmp中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供一种高产c-di-gmp的鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum，其是在鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum内敲除主磷酸二酯酶基因chr1_233。

9、本发明的第八个目的是提供一种高产c-di-gmp的鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum，其是在鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum内超表达主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体。

10、优选，所述的鞘氨醇菌sphingobiumxenophagum是鞘氨醇菌sphingobiumxenophagumc2。

11、本发明通过分别敲除食异源物鞘氨醇菌sphingobiumxenophagumc2菌株基因组中10个具有ggdef/eal双结构域的c-di-gmp合成降解酶中的磷酸二酯酶eal结构域，获得了在c2菌株细胞内行使c-di-gmp降解功能具有决定性作用的主磷酸二酯酶基因chr1_233，通过敲除主磷酸二酯酶基因chr1_233使s.xenophagumc2菌株胞内合成的c-di-gmp浓度提高了4.83倍。通过分析chr1_233基因突变株s.xenophagumc2(δ233)体内的16个与c-di-gmp合成与降解相关的基因表达变化，获得了在c2菌株细胞内行使c-di-gmp合成功能具有决定性作用的主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457，利用4-异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子序列构建了主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457的诱导型表达质粒pcmt_457，在50μm的4-异丙基苯甲酸诱导下使s.xenophagumc2菌株胞内合成的c-di-gmp浓度提高了6.58倍；利用s.xenophagumc2基因组中的强启动子tf962序列构建了主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457的组成型表达质粒ptf962_457，在强启动子tf962作用下使s.xenophagumc2菌株胞内合成的c-di-gmp浓度提高了9.15倍；通过体外点突变方法进行了主二鸟苷酸环化酶chr1_457活性抑制位点r187到p187的改造，利用强启动子tf962序列构建了改造后的主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457-r187p的组成型表达质粒ptf962_457-r187p，在强启动子tf962作用下使s.xenophagumc2菌株胞内合成的c-di-gmp浓度提高了16.21倍。通过上述理性设计与改造食异源物鞘氨醇菌体内的c-di-gmp合成与降解通路以及主二鸟苷酸环化酶的活性抑制位点，构建了一系列大量合成天然c-di-gmp的基因工程菌，为业内提供了一种绿色、简单、经济、高效的天然c-di-gmp生产方法，为制备sting激动剂或免疫佐剂、或者制备治疗与sting蛋白功能相关疾病的药物提供了一系列质优价廉的原材料。

技术特征：

1.主磷酸二酯酶基因chr1_233，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.敲除鞘氨醇菌sphingobium xenophagum中的权利要求1所述的主磷酸二酯酶基因chr1_233在提高菌株胞内合成c-di-gmp中的应用。

3.主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体，其特征在于，主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457的核苷酸序列如seq id no.3所示，突变体的核苷酸序列如seq id no.6所示。

4.在鞘氨醇菌sphingobium xenophagum中超表达权利要求3所述的主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体在提高菌株胞内合成c-di-gmp中的应用。

5.启动子tf962，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.5所示。

6.利用权利要求5所述的启动子tf962启动权利要求3所述的主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体在鞘氨醇菌sphingobium xenophagum中超表达主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体在提高菌株胞内合成c-di-gmp中的应用。

7.一种高产c-di-gmp的鞘氨醇菌sphingobium xenophagum，其特征在于，是在鞘氨醇菌sphingobium xenophagum内敲除权利要求1所述的主磷酸二酯酶基因chr1_233。

8.一种高产c-di-gmp的鞘氨醇菌sphingobium xenophagum，其特征在于，是在鞘氨醇菌sphingobium xenophagum内超表达权利要求3所述的主二鸟苷酸环化酶基因chr1_457或其突变体。

9.根据权利要求7或8所述的鞘氨醇菌sphingobium xenophagum，其特征在于，所述的鞘氨醇菌sphingobium xenophagum为鞘氨醇菌sphingobium xenophagum c2。

技术总结
本发明公开了一种大量合成天然环二鸟苷酸的基因工程菌及其应用。是在鞘氨醇菌Sphingobium xenophagum C2内敲除权利要求1所述的主磷酸二酯酶基因chr1_233。本发明理性设计与改造食异源物鞘氨醇菌体内的c‑di‑GMP合成与降解通路以及主二鸟苷酸环化酶的活性抑制位点，构建了一系列大量合成天然c‑di‑GMP的基因工程菌，为业内提供了一种绿色、简单、经济、高效的天然c‑di‑GMP生产方法，为制备STING激动剂或免疫佐剂、或者制备治疗与STING蛋白功能相关疾病的药物提供了一系列质优价廉的原材料。

技术研发人员：陈杏娟,许玫英,姚晖
受保护的技术使用者：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17