一种载体、透明质酸高产菌株及其构建方法与应用

本发明属于基因工程，尤其是一种载体、透明质酸高产菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、透明质酸(hyaluronan or hyaluronic acid，ha)又称为玻尿酸，是一种由n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)和d-葡萄糖醛酸(glca)以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接组成的高聚合大分子黏性多糖，由于其独特的生物活性，已广泛应用于医药、日化和材料等应用领域。

2、ha在自然界中广泛分布于脊椎动物的各种组织细胞间质和部分细菌荚膜中，是自然界最亲水的分子之一，被称为天然保湿剂，参与许多重要的生理生化过程和机体代谢。例如维持细胞水分和渗透压平衡，作为关节腔润滑液和缓冲带，以及作为大分子胶状结构填充剂，且ha经常参与细胞的固定或参与胞内的信号传导等。ha是细胞外基质的重要组成部分，在生物体内具有非常重要的功能，由于其具有保湿能力、粘弹性、抗机械损伤、缺乏免疫原性等优点，是一种可应用于不同医药前景的生物材料。

3、目前，传统生产ha的方法主要有动物组织提取法、体外酶法制备和微生物发酵法，通过动物组织提取法提取的ha的生产成本较高且提取的ha质量受到交叉感染风险的严重限制；酶法合成需要大量的糖核苷酸作为反应底物，昂贵的前体物质一定程度上限制了该方法的使用；如今利用微生物发酵法生产ha已成为了主流发展方向。

4、群体感应(quorum sensing，qs)是细菌依赖群体密度，通过信号分子的产生、释放、积累和感应进行种间或种内的信息交流，最终表现出多个细菌合作完成特定生理功能的种群密度依赖的基因表达调控系统，是细菌合成功能因子的重要调控系统。ai-2作为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌所共有的群体感应分子，是一种呋喃基硼酸二酯，由s-腺苷-同型半胱氨酸(sah)再循环生成同型半胱氨酸，作为种间交流的通用信号。s-腺苷-同型半胱氨酸(sah)通过两个酶促步骤(pfs酶和luxs酶)合成，产生4,5二羟基2,3戊二酮(dpd)，dpd经过自发环化，然后与硼酸盐络合形成ai-2。负责ai-2合成最后一个酶促步骤的luxs酶存在于广泛的细菌属系统发育范围内，同样存在于兽疫链球菌中调控生物被膜生长和毒力因子的表达以及调控透明质酸的生产。

5、专利公开文献cn 112592930 b公开了一种高产透明质酸的马链球菌兽疫亚种atcc39920的工程菌，该工程菌是在马链球菌兽疫亚种atcc39920中过表达glna基因和启动子ppgk构建得到的。该重组菌株通过影响谷氨酰胺的代谢循环，得到ha产量为0.48g/l，产量较低。

6、因此，针对目前市场对ha(透明质酸)的巨大需求，而现有技术中提高ha产量的菌株改造方法较少、产量提高难度大的问题，亟需研究ha的制备，特别是利用基因工程和代谢工程手段，构建高产ha的工程菌株，具有重要的理论意义和市场需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种载体、透明质酸高产菌株及其构建方法与应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种含有与群体感应系统相关的基因luxs的过表达载体，所述载体将luxs共531bp基因片段插入初始载体pdl278载体的多克隆位点处，构建了载体pdl278::luxs，其次连接长度为79bp的pr22表达元件(启动子+rbs)，构建过表达质粒pdl278::pr22::luxs；

4、其中，所述luxs的基因序列为seq id no.1，所述pr22表达元件的基因序列为seqidno.2。

5、进一步地，所述luxs来源于兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)atcc39920；所述pr22表达元件来源于兽疫链球菌atcc 39920，luxs和pr22表达元件分别以atcc39920基因组为模板通过pcr技术扩增得到的。

6、利用如上所述载体的透明质酸高产菌株，所述菌株为将基因luxs过表达质粒pdl278::pr22::luxs转入宿主菌，获得过表达luxs基因功能的工程菌。

7、进一步地，所述宿主菌为兽疫链球菌(streptococcuszooepidemicus)atcc39920。

8、如上所述的透明质酸高产菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

9、步骤1，构建基因luxs过表达质粒：以野生型兽疫链球菌atcc 39920基因组为模板，通过pcr反应分别扩增获得基因luxs以及pr22表达元件的序列片段；将所述基因luxs的片段克隆到载体pdl278上，得到载体pdl278::luxs，将pr22表达元件的序列片段克隆到载体pdl278::luxs，构建过表达质粒pdl278::pr22::luxs即plh2154；

10、步骤2，luxs基因过表达菌株的获得：将所述质粒plh2154转入至宿主菌兽疫链球菌atcc39920，即获得luxs基因过表达菌株s3906,即得透明质酸高产菌株。

11、进一步地，所述转入为电转入。

12、如上所述的透明质酸高产菌株在提高透明质酸产量方面的应用。

13、一种利用如上所述的菌株发酵制备透明质酸的方法，包括如下步骤：

14、取透明质酸高产菌株的fsb发酵培养基，按接种量2-8％向发酵培养基中接入工程菌株，37℃，ph7.0，转速150-300r/min，发酵24小时，即得透明质酸；

15、其中，所述fsb发酵培养基为：蔗糖：30-50g/l，酵母提取物：2-3.5g/l，酪蛋白胨：8-10g/l，nacl：1-1.5g/l，k2hpo4：2-7g/l，mgso4·7h2o：0.4-0.6g/l。

16、进一步地，具体步骤如下：

17、摇瓶发酵：

18、从-80℃冰箱取出透明质酸高产菌株，在thy固体培养基上划线，37℃，培养12h，挑取长出的单菌落接种到装有4mlthy液体培养基的试管中，37℃，转速200r/min，培养12h，将菌液以2％接种量，接种到装有50ml thy液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃，转速150-300r/min，培养12h，将菌液以2-8％的接种量，接种到装有100ml fsb发酵培养基的500ml锥形瓶中，37℃，ph 7.0，转速150-300r/min，发酵24h，即得透明质酸；

19、其中，所述thy固体培养基为：牛肉浸粉：10.0g/l，胰蛋白胨：20.0g/l，葡萄糖：2.0g/l，酵母浸出物：2.0g/l，nahco3：2.0g/l，nacl：2.0g/l，na2hpo4：0.4g/l，琼脂：质量浓度1.5％；

20、所述fsb发酵培养基为：蔗糖：30-50g/l，酵母提取物：2-3.5g/l，酪蛋白胨：8-10g/l，nacl：1-1.5g/l，k2hpo4：2-7g/l，mgso4·7h2o：0.4-0.6g/l。

21、进一步地，发酵获得的透明质酸的产量为0.62g/l。

22、本发明取得的优点和积极效果为：

23、1、本发明方法通过构建一种含有与群体系统相关的基因luxs的过表达载体，将过表达载体转入宿主菌，利用抗性筛选标记获得luxs基因功能的工程菌。本发明将过表达luxs基因的重组菌进行发酵分析，经过37℃，ph7.0，转速150-300r/min，发酵24小时，得到ha产量为0.62g/l，与野生型兽疫链球菌相比，透明质酸分子量提高了14％左右。为提升透明质酸产量提供了新方法，并获得了一株透明质酸的高产菌株。

24、2、本发明方法利用同源重组技术获得luxs基因过表达菌株，插入spc抗性筛选标记。

25、3、本发明基因工程菌株应用于透明质酸的高效生产，通过发酵法可以获得稳定的高产透明质酸。该基因工程菌株具有很好的工业化应用前景。本发明将过表达luxs基因的重组菌进行摇瓶发酵分析，利用ctab法测定ha的产量，得到产量为0.62g/l的ha，与野生型兽疫链球菌相比，透明质酸产量提高了14％左右。

26、4、本发明是在本技术人对群体感应系统相关基因luxs的深入研究基础上实现的，luxs通过合成群体感应分子ai-2的前体物质4,5二羟基2,3戊二酮(dpd)影响生物被膜的形成，而生物被膜与透明质酸合成有正相关性，通过过表达luxs促进了生物被膜的形成而提高了透明质酸的产量。基于此发现，本发明构建了新型的ha高产菌株。