一种提高重组VSV病毒载体感染效率的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种提高重组vsv病毒载体感染效率的方法。

背景技术：

1、在各种疫苗形式中，活病毒载体疫苗由于能引起相对最强的免疫反应和最佳的保护效果，现已成为新型疫苗研发的重点，而病毒载体的选择是疫苗成功的关键。在现有的各种活病毒疫苗载体中，水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，vsv)具有人群中血清阳性率低；能诱导粘膜免疫；基因组简单，易于规模化生产等突出的优点，被认为是最具有开发潜力的病毒疫苗载体之一。

2、vsv病毒目前用的是293、vero、bhk等贴壁细胞培养，培养过程需加入血清，有研究结果表明，细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，且存在胎牛血清昂贵、批次之间有差异导致贴壁培养的细胞有批次之间的差异、产毒量不稳定、贴壁培养不易放大等缺点，因此无血清悬浮培养成为vsv病毒大规模生产的趋势，但是无血清培养的细胞病毒产量较低，提高病毒感染效率是我们需要解决的重要工艺问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中贴壁培养需要血清，存在污染外源病毒和致病因子的风险、无血清培养感染效率较低，从而导致病毒产量低的问题，提供一种提高重组vsv病毒载体感染效率的方法。

2、本发明的目的可以通过以下方案来实现：

3、本发明公开了一种提高重组vsv病毒载体感染效率的方法，包括如下步骤：

4、(1)将细胞加入无血清培养基中，调正至一定密度，并加入一定浓度β-1，3葡聚糖，平衡处理；

5、(2)将重组vsv病毒按一定moi接种至平衡后的细胞，感染后24-35小时收获上清。

6、作为本发明的一个实施方案，步骤(1)中，所述细胞包括293细胞、bhk细胞、vero细胞中的一种。

7、作为本发明的一个实施方案，步骤(1)中，所述调整密度为5e5-4e6 cells/ml。

8、作为本发明的一个实施方案，步骤(1)中，所述培养基包括sfm4transfx-293培养基、dm/f12培养基、pro293培养基中的一种。

9、作为本发明的一个实施方案，步骤(1)中，β-1，3葡聚糖加入后的终浓度为0.2-10mg/ml。在病毒感染时添加一定浓度的β-1，3葡聚糖溶液，可提高病毒感染效率。

10、vsv病毒有囊膜，其病毒体结构呈弹状或杆状，拥有一条单链负义rna基因组(-ssrna)，并且其复制依赖病毒的rna聚合酶(rna-dependent rnapolymerase，rdrp)，病毒最外面是包膜糖蛋白(g)。病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳蛋白n，里面包裹了病毒的基因组(-ssrna)，这种n和-ssrna形成的复合物叫做核糖核蛋白(rnp)，rdrp结合在rnp上。vsv感染靶细胞时，g糖蛋白介导病毒包膜与细胞膜融合，将rnp和rdrp从包膜中释放到细胞质中，rdrp以rnp中的负义rna基因组为模板立即启动一级转录，而作为转录产物的正义rna链被进一步翻译，用于生产介导病毒基因组复制、二级转录、病毒组装和出芽等病毒等功能的后期蛋白。病毒的rna无感染性，但是病毒的核衣壳复合物(rnp+rdrp)含有转录酶，具有感染性。

11、当病毒包膜不完整，容易导致内部的核衣壳提前释放，在无包膜的融合作用下，病毒很难进入到细胞中，在β-1，3葡聚糖的作用下，增加细胞的内吞作用，从而增加了病毒的感染效率。

12、作为本发明的一个实施方案，步骤(1)中，平衡时间为30-60min，具体为：放入摇床，设置参数为35℃、8％co2、50mm-120rpm。

13、作为本发明的一个实施方案，步骤(2)中，重组vsv病毒接种时的moi为0.001-0.01。

14、作为本发明的一个实施方案，步骤(2)中，病毒感染的温度为34-37℃，时间为24-35小时。

15、适用于重组vsv病毒载体不局限于印第安纳(indiana，in)株和新泽西(newjersey，nj)株。

16、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

17、无血清细胞培养时，病毒感染复数、β-1，3葡聚糖浓度以及感染细胞密度对感染效率都有一定影响，因此优化病毒接种量和β-1，3葡聚糖浓度，可以提高单细胞病毒产量。

技术特征：

1.一种提高重组vsv病毒载体感染效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞包括293细胞、bhk细胞、vero细胞中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述调整密度为5e5-4e6cells/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养基包括sfm4transfx-293培养基、dm/f12培养基、pro293培养基中的一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，β-1，3葡聚糖加入后的终浓度为0.2-10mg/ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，平衡时间为30-60min，具体为：放入摇床，设置参数为35℃、8％co2、50mm-120rpm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，重组vsv病毒接种时的moi为0.001-0.01。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，病毒感染的温度为34-37℃，时间为24-35小时。

技术总结
本发明涉及一种提高重组VSV病毒载体感染效率的方法，包括如下步骤：将细胞加入培养基中，调整密度，并加入β‑1，3葡聚糖，平衡处理；将重组VSV病毒接种至平衡后的细胞，感染后收获上清。本发明在无血清细胞培养时，病毒感染复数、β‑1，3葡聚糖浓度以及感染细胞密度对感染效率都有一定影响，因此优化病毒接种量和β‑1，3葡聚糖浓度，可以提高单细胞病毒产量。

技术研发人员：付任贞,王海峰
受保护的技术使用者：上海佰炼生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17