一株高产DHA的裂殖壶菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，具体涉及一株高产dha的裂殖壶菌(schizochytriumsp.)，还涉及所述裂殖壶菌在生产dha中的应用。

背景技术：

1、dha(docosahexaenoic acid,22:6△4.7.10.13.16.19，二十二碳六烯酸)是一种重要的长链多不饱和脂肪酸，广泛应用在医疗保健用品、食品以及饲料等行业。从深海鱼类中提取的鱼油是目前epa和dha的主要来源，但由于成本较高而难以广泛应用。研究发现一些海洋微藻和海洋真菌能自身合成dha，并且其相对含量远高于鱼油中的dha含量，其主要以储存油和膜脂形式存在。因此，利用微生物发酵生产dha可以克服从鱼油获取dha不足的缺陷，且产量和含量更稳定而具备商业价值。

2、中国发明专利申请cn 114437947a公开了一株高蛋白、高dha的裂殖壶菌cgmccno.40082及其作为饲料添加剂的应用，该菌株蛋白质含量达到45.37％，dha产量达到16.21g/l。美国专利us 8187845b2利用裂殖壶菌发酵生产dha油的过程中通过控制溶解氧的水平，将细胞干重提高到200g/l，dha产量提升到40g/l。任良栋等人采用松花粉垂钓法分离得到一株dha高产菌schizochytrium sp.zr-01，优化发酵条件后在最适发酵条件下得到72.1g/l的细胞干重和21.7g/l的dha含量(任良栋,许团辉,徐权汉等.一株高产dha菌株的筛选及其发酵条件优化[j].中国油脂,2016,41(05):60-64.)。

3、根据这些现有技术的记载，dha产量最高可达40g/l，但是对于dha的稳定性均没有进行描述，因此无法知道所产生的dha相关活性及品质是否达到较高水平。

4、因此，寻求获得更高的dha产量、并确认产物中具有更高的维生素e含量依然是本技术领域想要解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一株新的裂殖壶菌(schizochytriumsp.)，以期获得产量更高的dha油，且发酵产物更稳定，活性及品质更高。

2、为了实现上述目标，本发明提供一株裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01，该菌株已于2023年6月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为cgmcc no.27700。

3、在本发明中，裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01是经过复合诱变得到的。首先，从国内多地临海区域采集水样，用灭菌的松花粉富集水样中的菌体。挑取富集菌体的松花粉于固体培养基上，经过培养后挑取能够使尼罗红染色液显红色的菌落，接种到发酵培养基中发酵，发酵结束后提取发酵液中的dha油，通过气相检测发酵液中的dha含量，挑选出生产dha油多的菌株，得到原始菌株。

4、将原始菌株活化后，然后挑取菌落溶于装有玻璃珠的10ml无菌水中，震荡混匀后得到菌悬液，梯度稀释获得od600为0.4-0.6的菌悬液。取10ml菌悬液置于无菌培养皿中，在15w紫外灯的30cm处照射30s，然后避光培养1h，再向培养皿中加入0.1m的亚硝酸钠，在28℃、200rpm培养3min。

5、诱变结束后，立即加入磷酸氢二钠溶液终止反应。将诱变后的菌悬液进行梯度稀释，然后涂布于平板培养基上，挑取长出的单菌落接入装有种子培养基的96孔板中培养，种子液以5％的接种量接入96孔板发酵培养基中，在28℃，200rpm摇床中培养，结合尼罗红显色法，用酶标仪在570nm处检测荧光强度，根据红色荧光强度筛选高油脂含量的菌株。

6、采用18s rdna方法确认筛选的菌株的18s rdna与裂殖壶菌具有99％的同源性，因此，定名为schizochytrium sp.h sc-01。

7、基于此，本发明还提供上述的裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01在生产dha中的应用。

8、本发明还提供裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01发酵合成dha油的方法，所述方法包括以下步骤：

9、(1)平板活化

10、取冻存的裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01稀释涂布在固体平板上，将平板倒置于28℃培养箱中培养至长出菌落；

11、(2)种子发酵

12、接一环菌到种子培养基中，在28℃培养48-72h，转速为200rpm；

13、(3)发酵罐发酵

14、将种子液按照5％的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，在28℃、搅拌转速200rpm，通气比为lvvm的条件下发酵培养48h。

15、优选地，步骤(1)的固体平板培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁4g/l，琼脂粉20g/l，初始ph 6.2，其余为水，在121℃下灭菌20min，倒在平板上得到固体平板。

16、步骤(2)的种子培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁4g/l，其余为水，调节ph为6.2，在121℃下灭菌20min得到种子培养基。

17、步骤(3)的发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁4g/l，其余为水，调节初始ph为6.2，在121℃下灭菌20min得到发酵培养基。

18、根据一种优选的实施方式，在进行发酵罐发酵时，所述发酵罐为装有4l发酵培养基的5l发酵罐。

19、将本发明的裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-00在发酵罐中发酵，发酵结束后用气相色谱仪测定发酵液中dha油的浓度，实际测得dha油的产量为42g/l，另外检测出dha油中维生素e含量为126mg/l，通过加速氧化实验证明本发明的裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01发酵产生的dha油活性相当稳定，其品质显著高于现有技术。

20、微生物信息：裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01，2023年6月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为cgmcc no.27700。

技术特征：

1.裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01，所述裂殖壶菌(schizochytrium sp.)hsc-01于2023年6月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为cgmcc no.27700。

2.权利要求1所述裂殖壶菌(schizochytrium sp.)h sc-01在生产dha中的应用。

3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于裂殖壶菌(schizochytriumsp.)h sc-01发酵生产dha，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(1)的固体平板培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁4g/l，琼脂粉20g/l，初始ph 6.2，其余为水，在121℃下灭菌20min，倒在平板上得到固体平板。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(2)的种子培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁4g/l，其余为水，调节ph为6.2，在121℃下灭菌20min得到种子培养基。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(3)的发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉4g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁4g/l，其余为水，调节初始ph为6.2，在121℃下灭菌20min得到发酵培养基。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(3)中，将种子液按照体积比5％的接种量接种到含有4l发酵培养基的5l发酵罐中。

技术总结
本发明提供一株高产DHA的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)H Sc‑01，其保藏编号为CGMCC No.27700。将本发明的裂殖壶菌H Sc‑00在发酵罐中发酵，测得发酵液中DHA油的产量为42g/L，通过气相色谱法检测出所得DHA油中维生素E含量为126mg/L。通过加速氧化实验证明本发明的裂殖壶菌H Sc‑01产的DHA油活性稳定，过氧化值和TBARS值随时间增幅小于对照品，表明产品品质高于现有技术，具有显著优势。

技术研发人员：苟元元,杨璐,郭建琦,牛永洁,孟永宏,齐慧霞
受保护的技术使用者：陕西海斯夫生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17