一种临床样本中微生物富集方法与流程

本发明属于微生物基因检测，具体而言，涉及一种临床样本中微生物富集方法。

背景技术：

1、全面检测、无偏好性的宏基因组二代测序(mngs)在诊断领域具有强大的优势，因为不需要特殊探针和靶向引物，从而有助于快速检测病原体。然而，大多数的临床样本，比如肺泡灌洗液，脑脊液被广泛应用于mngs病原微生物检测，此类样本中病原体相较人源宿主细胞含量极微，且人细胞基因组为病原体微生物的10～10000倍，导致mngs测序时存在大量的人源背景干扰，通常人源数据会占总数据量的99％以上，严重影响病原体检测的灵敏度。因此，病原体的富集对临床样本中微生物的检测有重大作用。

2、现有的病原体富集体系有两种，一种是提取前富集主要发生在细胞层面，通过人源细胞与微生物细胞的差异，选择性裂解人源细胞，去除人源核酸后获得微生物细胞，并通过核酸提取步骤富集微生物核酸。另一种是提取后富集主要发生在核酸层面，细胞破碎后利用探针捕获的方法，反向特异性的捕获人源核酸，将剩余的未被捕获的微生物核酸进行检测，或者通过人源核酸与微生物核酸甲基化差异，完成富集。但是，该体系在应用过程中通过探针法进行提取后富集靶向性范围小而受到限制；甲基化差异很难区分宿主与真核微生物核酸(及部分原核生物核酸)，进而造成病原体富集效果差。因此，提取前富集的方式应用较为广泛。

3、目前常用的提取前富集利用差异裂解法的主要步骤是：①样本中加入温和的细胞裂解液室温孵育以促进人源细胞裂解，释放人源核酸；②核酸酶酶解消化释放出来的人源核酸；③裂解液裂解病原体细胞，释放病原体核酸；④用磁珠捕获病原体核酸，在磁力架的吸附作用下将病原体核酸进行纯化，最终获得富集后的病原体核酸。

4、但是，在提取前富集的方式中，需考虑临床微生物常见病原体细胞壁表面结构差异较大，存在刚性较强的革兰氏阳性细菌(表面肽聚糖层多)及真菌，同时存在细胞壁薄/不稳定的微生物(如支原体、衣原体及部分革兰氏阴性细菌等)，后者极易受到人源细胞破碎时的干扰而被去除，从而导致本类病原体在测序结果中的遗漏，贻误病情判断。

5、因此，非常需要开发一种兼容多种临床样本，利用广谱性高效性的微生物捕获材料可以富集多种病原体的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种临床样本中微生物富集方法。本发明通过利用磁性微生物捕获材料有效分离人源细胞与病原体，不破坏细胞结构的基础上进一步富集病原体。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明的一个方面提供了一种临床样本中微生物富集方法，所述方法包括以下步骤：

4、步骤一：制备纳米磁珠；

5、步骤二：将所得纳米磁珠浸泡于活化剂中超声处理进行活化，活化结束后用0.1～1mol/lpbs溶液进行洗涤，洗涤次数为3-5次，重悬于1％bsa水溶液中，然后加入0.1～0.5％甘露糖凝集素mbl与1～3％人体免疫球蛋白igg搅拌均匀并于35～40℃孵育20～30min，将磁珠从溶液中分离出来，得到具有微生物捕获能力的功能化纳米磁珠；

6、步骤三：将待测样本进行宿主细胞的收集，然后加入细胞处理剂进行处理，然后与上述得到的功能化纳米磁珠混合均匀后静置反应10～20min，然后200～400rpm下低速离心10～20s，离心后置于磁力架上吸附1～5min，吸附结束后吸弃上清液；

7、步骤四：最后用pbs缓冲液进行漂洗，收集磁珠，将病原体洗脱后进行核酸提取。

8、优选地，步骤一中所述纳米磁珠的制备过程如下：

9、将四氧化三铁纳米磁珠用10～15wt％稀酸溶液冲洗2～3次后静置于浓度为10～50mm银氨溶液中24～48h，取出，得到银离子修饰的纳米磁珠前驱体；

10、将所得银离子修饰的纳米磁珠与10～30g/l的羧甲基纤维素溶液混合均匀后于60～100℃下加热反应30～90min，待反应结束冷却至室温后取出纳米磁珠于600～800w的微波下处理3～5min，再于-40℃下冷冻干燥4～10h，得到粒径分布在200～400nm的银离子修饰的纳米磁珠。

11、优选地，所述稀酸为醋酸、柠檬酸、苹果酸、草酸中的一种或多种的混合。

12、优选地，步骤二中所述活化剂为sncl2-hcl水溶液；所述sncl2-hcl水溶液中，sncl2的浓度为20～40g/l，hcl的浓度为10～20wt％。

13、优选地，步骤二中所述超声条件为：频率60～100khz，时间30～60min。

14、优选地，步骤三中所述细胞处理剂的组成为：8～12mm的hepes，1～2mm的mgcl2，8～12mm的kcl，1～2％的胰酶，1～3％蛋白酶k，1％的np40。

15、优选地，步骤三中按照400～600μl/5×106个细胞的量加入细胞处理剂，所述处理方法为：5-15℃孵育10-20min。

16、优选地，步骤三中按照800～1000μg/5×106个细胞的量加入纳米磁珠。

17、优选地，步骤四中所述洗脱液为0.01～0.2m tris-hcl和0.001～0.01m edta。

18、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：

19、本发明通过银氨溶液对四氧化三铁纳米磁珠进行修饰得到银离子修饰的纳米磁珠前驱体，然后采用羧甲基纤维素在银离子修饰的纳米磁珠前驱体表面进行成膜化保护，得到银离子修饰的纳米磁珠，在使用前需要通过活化剂进行活化得到功能化纳米磁珠，该纳米磁珠相比于传统的四氧化三铁纳米磁珠具有更强的磁响应能力，能在外界磁场条件下从溶液环境中有效快速分离。另外，磁珠粒径小且均一，粒径分布在200～400nm之间，在溶液环境中具备良好的悬浮性，有利于磁珠和溶液中dna的相互接触，促进分离富集过程。

20、本发明的银离子修饰的纳米磁珠稳定性好，可长时间保存，在使用前需要使用活化剂进行活化。避免了其他物质的影响，提高结果的准确率。

21、本发明的富集方法在不破坏细胞结构的基础上对病原体进行富集，尤其可以保证表面脆弱微生物的富集，另外可以实现大体积样本中病原体的富集。

22、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

技术特征：

1.一种临床样本中微生物富集方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤一中所述纳米磁珠的制备过程如下：

3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，所述稀酸为醋酸、柠檬酸、苹果酸、草酸中的一种或多种的混合。

4.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤二中所述活化剂为sncl2-hcl水溶液；所述sncl2-hcl水溶液中，sncl2的浓度为20～40g/l，hcl的浓度为10～20wt％。

5.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤二中所述超声条件为：频率60～100khz，时间30～60min。

6.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤三中所述细胞处理剂的组成为：8～12mm的hepes，1～2mm的mgcl2，8～12mm的kcl，1～2％的胰酶，1～3％蛋白酶k，1％的np40。

7.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤三中按照400～600μl/5×106个细胞的量加入细胞处理剂，所述处理方法为：5-15℃孵育10-20min。

8.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤三中按照800～1000μg/5×106个细胞的量加入纳米磁珠。

9.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤四中所述洗脱液为0.01～0.2mtris-hcl和0.001～0.01m edta。

技术总结
本发明属于微生物基因检测技术领域，具体而言，涉及一种临床样本中微生物富集方法。本发明的富集方法包括以下步骤：制备纳米磁珠；将所得纳米磁珠活化，活化后加入甘露糖凝集素与人体免疫球蛋白进行孵育，得到具有微生物捕获能力的功能化纳米磁珠；将待测样本进行宿主细胞的收集，然后加入细胞处理剂进行处理，然后与功能化纳米磁珠混合均匀后静置反应、低速离心，后置于磁力架上吸附，吸附结束后吸弃上清液；最后用缓冲液进行漂洗，收集磁珠，将病原体洗脱后进行核酸提取。本发明通过利用磁性微生物捕获材料有效分离人源细胞与病原体，不破坏细胞结构的基础上进一步富集病原体。

技术研发人员：孟坤,邓涛,曹学敏,常玉俊,邢婉丽
受保护的技术使用者：北京博奥医学检验所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21