一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法与流程

本申请涉及生物，具体涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法。

背景技术：

1、干细胞(stemcell，sc)是一种未分化细胞，这些细胞保持着高度增殖、自我更新和分化潜能的特性。干细胞可以定向分化为血液、骨骼、大脑及皮肤等其他组织。可能作为修复系统修复受损细胞。干细胞又可分为胚胎干细胞，脐血干细胞，成体干细胞及生殖干细胞等类型。干细胞在成体组织中调控成体细胞增殖、分化、凋亡及保持细胞数目的平衡中起到十分重要的作用。

2、细胞疗法的兴起激发了对各种干细胞的研究热潮，骨髓、脐带、脐带血、脂肪、经血等多种成体组织中的成体干细胞(adult stem cells，ascs)，不仅克服了胚胎干细胞取材难、分化不确定及伦理问题等限制，同时能保持高效增殖能力和多向分化潜能，为细胞治疗提供了良好的种子细胞。人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，近年越来越多的研究表明，子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使子宫内膜始终保持自我更新和再生能力。

3、子宫内膜干细胞的来源丰富，同时也具有较强的增殖活性。作为ascs家族的重要成员，子宫内膜干细胞除表达cd29(>99％)、cd44(>99％)、cd73(>99％)、cd90(>95％)及cd105(>99％)等ascs表面标志物，具有较高分化潜能。此外，相较于骨髓间充质干细胞(bmscs)和脐带血来源的ascs等，子宫内膜干细胞不仅具有更佳的增殖活性，同时亦具有较强的遗传稳定性。在临床应用子宫内膜干细胞的安全性获得保障的前提下，其已在成骨、心肌、肝脏、子宫内膜及中风等疾病的治疗过程中展示了令人满意的效果。

4、由于子宫内膜组织中干细胞存量较少，因此，本领域技术人员致力于开发高效地子宫内膜干细胞提取方法，提供一种能提供更高纯度、更好增殖活性的子宫内膜干细胞的制备方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法。

2、为实现以上目的，本申请提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括以下步骤：

4、(1)无菌条件下取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液进行浸泡，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；

5、(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；

6、(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并加入质量/体积比为0.1％的消化液50ml，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；

7、(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的dmemf/12培养基内进行培养；

8、(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到co2孵箱内培养；

9、(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(v/v)胚牛血清的dmem/f12培养液终止消化；

10、(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为p1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入20-40重量份的生长刺激液，p2代以后按1:10的比例传代，继续培养至p5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。

11、进一步的，步骤(1)所述的样本浸泡液为含有20～200u/ml青霉素、0.2～2.0mg/ml链霉素和0.1～1.0mg/ml edta-na2的pbs缓冲液。

12、进一步地，步骤(2)所述的消化温度为37℃，1-5h。

13、进一步地，步骤(3)所述消化液为i型胶原酶和多肽溶液。

14、进一步地，所述ⅰ型胶原酶为质量百分含量为0.2％。

15、进一步地，所述ⅰ型胶原酶和多肽溶液的体积比为5-20:1。

16、进一步地，多肽的氨基酸序列为msgkpst或gstyaa或sdaapfn(由上海生工生物工程股份有限公司合成)。

17、进一步地，在步骤(1)中，样本与样本浸泡液的用量体积比为1:1-5。

18、进一步地，在步骤(5)中，所述细胞培养的接种密度为5～10×104cells/cm2；所述的细胞培养是在37℃、5％co2的细胞培养箱中进行培养。

19、进一步地，在步骤(7)中所述生长刺激液由以下重量份的组分组成：5-10份的甘露醇、1-2份的pdgf、2-5份的维生素c、2-5份的hepes和5-10份的氯化钠。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种含有多肽的消化液，分离提取方法操作简单，获得的子宫内膜干细胞存活率高、传代效率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力，干细胞表面标志物表达良好，能够对子宫内膜干细胞进行规模化的制备，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。

技术特征：

1.一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：步骤(1)所述的样本浸泡液为含有20～200u/ml青霉素、0.2～2.0mg/ml链霉素和0.1～1.0mg/mledta-na2的pbs缓冲液。

3.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：步骤(2)所述的消化温度为37℃，1-5h。

4.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：步骤(3)所述消化液为i型胶原酶和多肽溶液。

5.根据权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：所述ⅰ型胶原酶为质量百分含量为0.2％。

6.根据权利要求4所述子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：所述ⅰ型胶原酶和多肽溶液的体积比为5-20:1。

7.根据权利要求6所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为msgkpst或gstyaa或sdaapfn。

8.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：在步骤(1)中，样本与样本浸泡液的用量体积比为1:1-5。

9.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述细胞培养的接种密度为5～10×104cells/cm2；所述的细胞培养是在37℃、5％co2的细胞培养箱中进行培养。

10.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：在步骤(7)中所述生长刺激液由以下重量份的组分组成：5-10份的甘露醇、1-2份的pdgf、2-5份的维生素c、2-5份的hepes和5-10份的氯化钠。

技术总结
本发明涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括步骤：对获得的子宫内膜组织材料进行预处理；然后加入含有多肽的消化液，消化获得单细胞悬液；并对其进行原代培养和传代培养；即获得所述子宫内膜干细胞。本发明提供方法操作简单，获得的子宫内膜干细胞存活率高、传代效率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力，干细胞表面标志物表达良好，能够对子宫内膜干细胞进行规模化的制备，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。

技术研发人员：史辛艺
受保护的技术使用者：深圳新赛尔生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24