本发明属于生物材料制备,涉及一种酶催化制备nadp+的方法。
背景技术:
1、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称氧化型辅酶ⅱ,英文名:nicotinamideadenine dinucleotide phosphate,nadp+),是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等近百种酶的辅酶,主要是以还原形式存在于生物体内,活性基团是烟酰胺,通过其氧化还原而传递氢原子来进行生理功能。在所有生物的新陈代谢中都发挥着重要的作用,能够参与糖、脂、蛋白质三类物质代谢的绝大多数氧化还原反应。
2、nadp+在生物体内广泛存在,但是含量极低。目前nadp+的合成方法可以分为化学法、生物发酵法和生物酶法。其中,化学法以烟酰胺核糖为原料,反应路线长,反应条件苛刻,易生成副产物,收率低,同时需要使用有机溶剂,造成环境污染等问题。生物发酵法工艺技术较为成熟,但是原料耗费巨大,原子利用率低,生产成本较高。而酶催化合成nadp+则是一种更为高效的反应,具有反应温和、立体选择性强,转化率高等优点。
3、nad+磷酸化生成nadp+的合成途径中,目前已知唯一酶是nad激酶(nad kinase,nadk),激酶能够在atp和底物之间起到催化作用并转移磷酸基团,即nadk将atp上的磷酸基团转移到nad+上,从而生成nadp+。nadk根据磷酰基供体可分为两种,一种是atp/poly(p)依赖性nadk,可以利用atp或无机多聚磷酸;一种是atp依赖性nadk,只能利用核苷三磷酸。
4、目前,报道的nad激酶在制备nadp+的过程中存在转化率低、底物残留显著等问题,分离纯化困难以及后处理过程复杂,工业化生产成本居高不下。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种酶催化制备nadp+的方法。本发明的方法克服了现有技术中nadp+合成的转化率低、生产成本高,反应步骤复杂以及后处理过程繁琐等不足。
2、为达此目的,本发明采用以下技术方案:
3、一方面,本发明提供一种酶催化制备nadp+的方法,所述方法包括以下步骤:
4、在二价金属离子的存在下,以nad+和偏磷酸盐为底物,以nad激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂,反应制备得到nadp+。
5、本发明中以nad激酶和焦磷酸水解酶联合应用作为催化剂,nad激酶和焦磷酸水解酶可发挥协同催化作用,使得能够提高nadp+合成的转化率,降低生产成本,并且制备方法简单,无需繁琐的后处理过程。
6、优选地,所述二价金属离子为mg2+、co2+、mn2+或zn2+。
7、优选地,所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mm-50mm,例如5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm或50mm。
8、优选地,所述反应体系中nad+的质量百分比浓度为0.5%-10%,例如0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。
9、优选地,所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合。
10、优选地,所述偏磷酸盐与nad+的摩尔比为(0.2-1.0):1.0,例如0.2:1.0、0.3:1.0、0.4:1.0、0.4:1.0、0.5:1.0、0.6:1.0、0.7:1.0、0.8:1.0、0.9:1.0或1.0:1.0。
11、优选地,所述nad激酶的用量为nad+质量的1%-5%,例如1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5%。
12、优选地,所述焦磷酸水解酶的用量为nad+质量的1%-5%,例如1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5%。
13、在本发明中,所述nad激酶和焦磷酸水解酶的形态包括冻干粉体、菌液或菌泥。
14、优选地,所述反应体系的溶剂包括tris·hcl缓冲溶液、pbs缓冲溶液或水。
15、优选地,所述反应体系的ph为6.0-8.0,例如6.0、6.3、6.5、6.8、7.0、7.4、7.8或8.0。
16、优选地,所述反应的温度为20-40℃,例如20℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃或40℃,反应的时间为10-20h,例如10h、12h、14h、16h、18h或20h。
17、作为优选技术方案,本发明所述酶催化制备nadp+的方法具体包括以下步骤:
18、在二价金属离子的存在下,以nad+和偏磷酸盐为底物,以nad激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂,在ph为6.0-8.0下于20-40℃反应10-20h制备得到nadp+;
19、其中所述二价金属离子为mg2+、co2+、mn2+或zn2+,所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mm-50mm,反应体系中nad+的质量百分比浓度为0.5%-10%,所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合,所述偏磷酸盐与nad+的摩尔比为(0.2-1.0):1.0,所述nad激酶的用量为nad+质量的1%-5%,所述焦磷酸水解酶的用量为nad+质量的1%-5%,反应体系的溶剂包括tris·hcl缓冲溶液、pbs缓冲溶液或水。
20、相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
21、本发明中以nad激酶和焦磷酸水解酶联合应用作为催化剂,使得能够提高nadp+合成的转化率,降低生产成本,并且制备方法简单,无需繁琐的后处理过程。
1.一种酶催化制备nadp+的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述二价金属离子为mg2+、co2+、mn2+或zn2+。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mm-50mm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,所述反应体系中nad+的质量百分比浓度为0.5%-10%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述偏磷酸盐与nad+的摩尔比为(0.2-1.0):1.0。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,所述nad激酶的用量为nad+质量的1%-5%。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其特征在于,所述焦磷酸水解酶的用量为nad+质量的1%-5%;
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,所述反应体系的溶剂包括tris·hcl缓冲溶液、pbs缓冲溶液或水;
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤: