宫颈癌相关标志物、检测试剂、检测方法及治疗药物与流程

本发明属于生物医药技术和分子生物学领域，涉及用于人类宫颈癌诊断的宫颈癌相关标志物，针对宫颈癌相关标志物设计的检测试剂和使用此检测试剂对检测样本中宫颈癌相关标志物进行检测达到筛选宫颈癌的方法，以及能有效抑制宫颈癌发生发展的宫颈癌治疗药物。

背景技术：

1、液基细胞学检测是宫颈癌早期筛查的重要手段，但是其敏感性和特异性不足。宫颈活检广泛应用于宫颈癌检测，但是由于宫颈活检依赖于检查者经验，且有一定的创伤风险，亦导致无法推广。目前临床应用最为广泛的肿瘤标志物，如糖类抗原19-9（ca19-9）和糖类抗原12-5（ca12-5）等筛查宫颈癌，均缺乏一定的灵敏性和特异性。随着基因组学、蛋白组学以及代谢组学等生物技术的发展，越来越多的生物标志物已被发现或研究。因此，发现新的能够早期诊断宫颈癌的标记物可以对宫颈癌进行早期干预，延长病人的生存期。

2、微小核糖核酸（microrna，mirna）是一类长度在22个左右的核苷酸的非编码小rna分子，其通过转录后调控广泛参与了各种生命活动过程，包括肿瘤的发生、侵袭及转移等。越来越多的文献报道mirna在癌症的发生、发展、转移中起重要的功能，而且抑制或者过表达一些mirna能够抗癌。因此，针对宫颈癌，有必要去研究是否有mirna也能起到抗癌或延缓癌症发生发展的作用。

技术实现思路

1、针对现有技术，本发明的目的是提供一组与宫颈癌发生发展密切相关的宫颈癌相关标志物；提供针对本发明宫颈癌相关标志物而设计的一种宫颈癌检测试剂；提供一种使用本发明宫颈癌诊断用试剂对检测样本中的目标基因进行检测进而诊断宫颈癌的方法；提供一种能有效抑制宫颈癌发生发展的治疗药物。

2、为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一组宫颈癌相关标志物，其特征在于，由伴随宫颈癌的发生、发展，呈现过表达的两个标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223，以及呈现抑制表达的两个标志物hsa-mir-144和hsa-mir-8074构成；

4、所述标志物hsa-mir-10526的序列为aaaagggggctgaggtggag（seq id no.1），

5、所述标志物hsa-mir-223的序列为cgtgtatttgacaagctgagtt（seq id no.2），

6、所述标志物hsa-mir-144的序列为ggatatcatcatatactgtaag（seq id no.3），

7、所述标志物hsa-mir-8074的序列为ctatggcgagactggcatgtactc（seq id no.4）。

8、本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，筛选用于宫颈癌诊断和治疗的血清mirna标志物，从中选择hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144和hsa-mir-8074作为本发明宫颈癌诊断用标志物，在宫颈癌患者血清中，四个宫颈癌标志物的表现是：标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223上调，标志物hsa-mir-144和hsa-mir-8074下调。

9、针对本发明提供的四个宫颈癌标志物，本发明提供了联合检测宫颈癌标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144和hsa-mir-8074表达水平的宫颈癌检测试剂。

10、本发明提供了一种宫颈癌检测试剂，其特征在于，宫颈癌检测试剂中含有针对宫颈癌相关标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144和hsa-mir-8074设计的引物，将所述宫颈癌检测试剂用于pcr反应体系，用于检测受测样本中四个宫颈癌标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144和hsa-mir-8074的表达量； 所述宫颈癌检测试剂中含有的宫颈癌相关标志物的引物构成如下：

11、标志物hsa-mir-10526（seq id no.1）的上游引物hsa-mir-10526-f的序列为aaaagggggctgaggt（seq id no.5）；

12、标志物hsa-mir-223（seq id no.2）的上游引物hsa-mir-223-f的序列为cgtgtatttgacaagctg（seq id no.6）；

13、标志物hsa-mir-144（seq id no.3）的上游引物hsa-mir-144-f的序列为ggatatcatcatatactg（seq id no.7）；

14、标志物hsa-mir-8074（seq id no.4）的上游引物hsa-mir-8074-f的序列为ctatggcgagactggca（seq id no.8）；

15、四个宫颈癌标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144和hsa-mir-8074的通用下游引物universal rp的序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.9）。

16、所述的宫颈癌检测试剂中，还含有内参引物、taq酶、dntps、pcr缓冲液、mgcl、tagman探针、荧光定量pcr参比染料，或者含有上述组分中的一种或几种。

17、为了方便临床检测使用，可以将本发明提供的宫颈癌诊断用试剂及在本发明宫颈癌诊断方法中使用的其他试剂（如阳性对照品、阴性对照品、微滴生成油等）和工具制备成试剂盒。

18、本发明还提供了一种宫颈癌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

19、s1. 抽取被检测人员的外周血放入分离胶采血管中，经离心处理后得到外周血血清，经过抽提纯化后，得到含有总rna的待测血清样本；

20、s2. 制备cdna样本：取含有总rna的待测血清样本，配制加尾和逆转录反应体系，反应体系中的加尾试剂对小rna进行加尾，反应体系中的逆转录试剂对加尾后的小rna进行逆转录后，得到cdna样本；

21、s3. qpcr检测：配制包含cdna样本、宫颈癌检测试剂的qpcr反应体系，以cdna样本为模板，以rnu6-1为内参，使用real-time pcr仪检测cdna样本中四个宫颈癌标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144和hsa-mir-8074在血清中的相对表达量（δct值）；

22、s4. real-time pcr仪对检测结果进行判断：

23、将步骤s3测出的四个宫颈癌标志物的δct值输入如下综合判别公式：

24、综合判断值=-1.417+0.286*δct hsa-mir-10526+0.397*δct hsa-mir-223 -0.466* δct hsa-mir-144-0.120*δct hsa-mir-8074；综合判断值≥0，为阳性，患宫颈癌的风险较高；综合判断值＜0，为阴性，患宫颈癌的风险较低。

25、本发明宫颈癌检测方法对四个宫颈癌标志物进行检测和综合判读后判断受测者是否患有宫颈癌，大大提高了宫颈癌检测的准确性；本发明宫颈癌检测方法作为宫颈癌诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围广等特点。

26、本发明还提供了一种宫颈癌治疗药物，其特征在于，包括hsa-mir-10526、hsa-mir-223基因的抑制剂，以及hsa-mir-144、hsa-mir-8074基因的模拟物，用于抑制hsa-mir-10526、hsa-mir-223基因的表达，同时提高hsa-mir-144、hsa-mir-8074基因的表达；

27、所述hsa-mir-10526基因的抑制剂为hsa-mir-10526 inhibitor，hsa-mir-10526inhibitor的序列为ctccacctcagccccctttt（seq id no.10）；所述hsa-mir-223基因的抑制剂为hsa-mir-223 inhibitor，hsa-mir-223 inhibitor的序列为aactcagcttgtcaaatacacg（seqid no .11）；

28、所述hsa-mir-144基因的模拟物为hsa-mir-144 mimics，hsa-mir-144 mimics的序列为ggatatcatcatatactgtaag（seq id no.12）；所述hsa-mir-8074基因的模拟物为hsa-mir-8074 mimics，hsa-mir-8074 mimics的序列为ctatggcgagactggcatgtactc（seq id no.13）。

29、本发明的有益效果如下：

30、本发明提供了一组与宫颈癌发生发展密切相关的mirna标志物组合hsa-mir-10526、hsa-mir-223、hsa-mir-144、hsa-mir-8074作为宫颈癌诊断用标志物，在宫颈癌患者中标志物hsa-mir-10526、hsa-mir-223上调，标志物hsa-mir-144、hsa-mir-8074下调，本发明提供的宫颈癌相关标志物在宫颈癌检测中具有较高的诊断准确度。

31、本发提供的一种宫颈癌检测试剂中含有针对四个宫颈癌标志物特别设计的引物，以检测受测样本中四个宫颈癌标志物的表达量，具有检测灵敏度高、特异度好的特点。

32、本发明宫颈癌检测方法对四个宫颈癌标志物的表达量进行检测和综合判读后判断受测者是否患有宫颈癌，大大提高了宫颈癌检测的准确性，本发明宫颈癌检测方法作为宫颈癌诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围广等特点。

33、本发明提供的宫颈癌治疗药物，可以抑制hsa-mir-10526、hsa-mir-223基因的表达，同时提高hsa-mir-144、hsa-mir-8074基因的表达，对宫颈癌的发生、发展具有很好地抑制作用，在宫颈癌治疗中具有重要的参考意义和现实意义。