一种提高突变基因检测灵敏度的方法及其应用与流程

本申请涉及突变基因检测，具体而言，涉及一种提高突变基因检测灵敏度的方法及其应用。

背景技术：

1、基因突变检测可用于多种疾病的早期筛查、诊断及预后判断。多种恶性肿瘤，如恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌等存在不同比例的b-raf基因突变；结直肠癌、胰腺癌、肺癌等存在不同比例的k-ras基因突变。良性肿瘤的患者若是检出b-raf或k-ras基因突变，提示有肿瘤恶变的可能。pik3ca基因突变检测，对肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后具有重要意义。

2、目前突变基因检测主要通过高通量测序和荧光pcr的方法进行检测，由于肿瘤高度异质性，肿瘤基因样本中存在大量的正常序列，现有的检测方法难以检测到极低丰度的突变基因。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种提高突变基因检测灵敏度的方法，此方法能检测极低丰度的突变基因，提升突变基因检测的灵敏度。

2、本申请的另一目的在于提供一种提高突变基因检测灵敏度的方法在肿瘤突变基因检测中的应用，提高肿瘤突变基因检测的灵敏度。

3、本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

4、一方面，本申请实施例提供一种提高突变基因检测灵敏度的方法，其包括以下步骤：

5、s1、采集样本，提取dna；

6、s2、选用末端添加碱基a的taq酶扩增dna序列，得到扩增后的pcr产物；

7、s3、构建细菌质粒，该质粒中含有cas9蛋白、crispr sgrna序列和氨苄抗生素基因表达框，上述细菌质粒含有两个相邻的xcmi酶切位点，通过xcmi酶切制备t载体；

8、s4、利用快速连接酶将s2中扩增后的pcr产物克隆到上述细菌质粒中得到连接产物；

9、s5、将连接产物转染到细菌感受态细胞中，经过孵育得到菌液，随后将菌液涂布在含有氨苄抗生素的培养基中培养得到耐药菌落；

10、s6、挑取耐药菌落进行一代基因序列验证。

11、本申请中从样本中提取dna，通过pcr扩增的基因序列可以通过ta连接的方式高通量的克隆到含有可以剪切正常基因序列的crispr和氨苄抗生素表达框的细菌质粒中，然后再将该细菌质粒与现代商业化的感受态进行连接，并将该细菌感受态细胞徒步在含有氨苄抗生素的培养基中，正常基因序列会被crisper剪切并且不能在氨苄抗生素培养基中培养，而突变的基因序列就不会被crisper剪切，且正常形成细菌克隆，从而得到耐药菌落，然后耐药菌落可以作为是否含有突变基因检测结果的初步判断，然后提取耐药菌落进行一代基因测序验证，能够在除去正常基因序列的干扰下，有效提升突变基因检测的灵敏度。

12、另一方面，本申请实施例提供一种提高突变基因检测灵敏度的方法在肿瘤突变基因检测中的应用。

13、肿瘤细胞具有极高的异质性，一些极低丰度的突变基因难以通过常规的荧光pcr和测序方法检测到，采用分子克隆方法可以大分子数量的将突变基因和野生型基因序列克隆到表达载体中，克隆载体可以达到10的9次方的高通量，再经过细菌质粒转染到工程化的感受态细胞中，通过氨苄抗生素培养基的筛选，最后富集阳性耐药菌落，达到基因检测的目的，其方法简单，操作简便，还排除了正常基因序列的干扰，提升了肿瘤突变基因检测的灵敏度。

14、相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：

15、1、本申请提供的方法能够有效提升突变基因检测的灵敏度。

16、2、本申请提供的方法，操作简便，且容易验证，能够方便快捷的达到突变基因检测的目的。

技术特征：

1.一种提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s2中扩增的反应体系包括2×taq酶50μl、10μm正向引物2μl、10μm反向引物2μl、dna模板5μl和水41μl。

3.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s4中克隆时采用的反应体系中包括10×t4 dnabuffer 10μl、dna载体10μl、pcr纯化产物10μl、ddh2o60μl和t4 dna酶10μl。

4.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s5中的培养基为lb固体培养基。

5.根据权利要求2所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s5中菌液在培养基中培养的时间为12-24h，培养温度为37℃。

6.根据权利要求1-5任一项所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s5中将连接产物转染到细菌感受态中的具体操作为：

7.一种根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法在肿瘤突变基因检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述突变基因为egfr t790m。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

技术总结
本申请提出了一种提高突变基因检测灵敏度的方法及其应用，涉及突变基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：采集样本，提取DNA；选用末端添加碱基A的Taq酶扩增DNA序列，得到扩增后的PCR产物；构建细菌质粒，该质粒中含有CRISPR和氨苄抗生素基因表达框，细菌质粒含有两个相邻的XcmI酶切位点，通过XcmI酶切制备T载体；利用快速连接酶将扩增后的PCR产物克隆到上述细菌质粒中得到连接产物；将连接产物转染到细菌感受态细胞中，经过孵育得到菌液，随后将菌液涂布在含有氨苄抗生素的培养基中培养得到耐药菌落；挑取耐药菌落进行基因序列验证。本申请提供的方法灵敏性高，还能够应用到肿瘤突变基因检测。

技术研发人员：熊亚明,刘志鹏,陈奕豪,李佩贤,罗微
受保护的技术使用者：佛山市第一人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24