一种用于室温检测RNA的组合物及试剂盒

本发明涉及核酸检测，特别涉及一种用于室温检测rna的组合物及试剂盒。

背景技术：

1、目前，广泛使用的病原体检测方法是抗原检测法和定量聚合酶链反应(qpcr)。qpcr技术十分灵敏，但反应时间长，且依赖于专业的操作技术和价格昂贵的设备，不适用于即时检测。抗原检测可以在室温下15-30分钟内产生结果，然而，其灵敏度明显低于qpcr，导致结果准确性低，假阴性率高。等温扩增方法，如重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导等温扩增(lamp)，反应速度快，可以在5-30分钟内产生结果，且灵敏度高，与qpcr相似，但特异性较差，具有假阳性率。

2、crispr-cas(crispr相关蛋白)系统现已被用于开发病原体检测试剂盒。cas12或cas13在引导rna(grna)特异性识别、切割目标核酸序列后，其非特异性核酸酶活性被激活，快速切割单链rna或单链dna，这一现象被称为反式切割。在单链dna或单链rna两端分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，将其制备成荧光报告基因，cas蛋白切割此报告基因会生成明显的荧光信号，可以由荧光读数仪检测到。crispr-cas特异性高，反应速度快，5-10分钟内出结果，使其在核酸检测方面具有卓越的应用潜力。但crispr-cas灵敏度低，单独使用cas13核酸酶需要数小时才能达到阿托摩尔级的灵敏度，因此，联合等温扩增和crispr是诊断病毒样本的最佳方案。基于cas13a的夏洛克(sherlock)方法分为rpa扩增和crispr检测两个步骤，其灵敏度比仅使用cas13的灵敏度有显著提高。然而，多个步骤的整合会增加复杂性，延长反应时间，升高交叉污染风险等。整合等温扩增和crispr检测到一个步骤中，能够降低两步法的复杂性和交叉污染风险，此技术被称为一步核酸检测方法。基于cas13a的经典一步法shine通过联合重组酶聚合酶等温扩增技术和lwacas13a切割技术实现病原体检测。在37℃条件下，shine利用30个核苷酸的rpa反向引物启动反转录过程，合成出病原体rna的cdna，利用5’端包含t7 rna聚合酶启动子序列的rpa正向引物扩增出双链dna扩增子，t7 rna聚合酶识别扩增子上的启动子序列，并转录出与病原体rna序列相同的短链rna，接着，lwacas13a在crrna指导下识别、切割短链rna的特定区域，其非特异切割活性被激活，并快速切割rna报告分子，释放荧光基团。荧光读取仪读出的荧光信号即为病原体检测的阳性结果，若无荧光信号，则为阴性结果。大多数crispr检测方法的灵敏度远远超过抗原测试，但其需要购置温度控制设备，成本高，限制了其在即时检测方面的应用。因此，提高等温扩增和cas13a一步法在室温下的反应活性，使其检测速率和灵敏度与37℃等同，摆脱温控装置，降低成本，使其更适合发展为快速、即时的核酸检测方法，更适用于自检和床旁诊断。

技术实现思路

1、针对现有cas13a检测方法的反应时间长、灵敏度低、成本高等问题，本发明将目标rna的反向互补序列作为cas13a的切割靶标，以降低cas13a切割对反转录和等温扩增反应的干扰；同时缩短反转录引物的长度，加快反应速率，并优化rpa反向引物、rpa正向引物、反转录引物、taqman荧光探针的浓度拓宽反应的温度范围和检测灵敏度，实现在20℃下30分钟内检测0.5cp/μl sars-cov-2rna的能力。

2、本发明提供的技术方案具体如下：

3、第一方面，本发明提供一种用于室温检测rna的组合物，包括：

4、目标rna的反转录引物和反转录酶，用于合成目标rna的反向互补序列，所述反转录引物的长度为10～20个核苷酸；

5、rpa反向引物、rpa正向引物、重组酶、dna聚合酶、t7 rna聚合酶，用于扩增目标rna的双链dna扩增子，并以双链dna扩增子为底物合成包含目标rna的反向互补序列的长链rna；所述双链dna扩增子由目标rna及其反向互补序列碱基互补配对形成，rpa反向引物的5’端包含t7 rna聚合酶启动子序列；

6、cas13a蛋白及其crrna，所述crrna用于靶向识别目标rna的反向互补序列，所述cas13a蛋白用于切割目标rna的反向互补序列；

7、taqman荧光探针，其能在目标rna的反向互补序列被切割时被cas13a蛋白非特异切割，释放荧光基团。

8、本发明提供的一些实施方式中，所述反转录引物的长度为12～16个核苷酸，示例性的，反转录引物的长度为12、13、14、15或16个核苷酸。

9、本发明提供的一些优选的实施方式中，所述反转录引物的长度为14个核苷酸。

10、本发明提供的一些实施方式中，所述cas13a蛋白为lwacas13a、lbacas13a、lshcas13a、pprcas13a、erecas13a、lneca3a、camcas13a、rcacas13a、hhecas13a、lbucas13a、lsecas13a、lbmcas13a、lbncas13a、rcscas13a、rcrcas13a、rcdcas13a、cgcas13a、cg2cas13a、lwecas13a、lbfcas13a、lba4cas13a、lba9cas13a、lnecas13a、hhecas13a、rcacas13a中的至少一种。

11、本发明提供的一些优选的实施方式中，所述cas13a蛋白为lwacas13a或lbucas13a。

12、本发明提供的一些实施方式中，目标rna的反转录引物的浓度为100-1000nm；rpa反向引物的浓度为50-500nm；rpa正向引物的浓度为150-1000nm。

13、本发明提供的一些实施方式中，taqman荧光探针的浓度为100-1000nm。

14、本发明提供的一些实施方式中，所述taqman荧光探针的荧光淬灭基团为bhq、bhq1、bhq2或tamra，荧光报告基团为fam、cy3、cy5、hex或tet。

15、本发明提供的一些实施方式中，目标rna为sars-cov-2的rna，其序列为acugagaucuuucauuuuaccgucacca(见seq id no:2)；

16、所述crrna为

17、gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuggugacggu aaaaugaaagaucucagu(见seq id no:10)；

18、目标rna的反转录引物的序列为：ttttggtgtattca(见seq id no:17)；rpa反向引物的序列为：

19、ccggtaatacgactcactatagggcccatatgatgccgtctttg(见seq id no:16)；

20、rpa正向引物的序列为：cctcgaggacaaggcgttccaattaa(见seq id no:15)；

21、所述taqman荧光探针的rna序列为uuuuu、uuuuuu、uuuuuuu、uuuuuuuu中的至少一种。

22、本发明提供的一些优选的实施方式中，taqman荧光探针为fam-uuuuuu-bhq1。

23、本发明提供的一些实施方式中，所述室温核酸检测试剂盒还包括rnase抑制剂、rnase h、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液、反应激活剂。

24、第二方面，本发明提供一种室温核酸检测试剂盒，包括上述用于室温检测rna的组合物。

25、本发明提供的一些实施方式中，所述室温核酸检测试剂盒包含：20-200nm的lwacas13a或lbucas13a，10-100nm的crrna，1.5-2.5u/μl的反转录酶，50-500ng/μl的t7rna聚合酶，100-1000nm的taqman荧光探针，50-500nm的rpa反向引物，150-1000nm的rpa正向引物，100-1000nm的反转录引物。

26、本发明提供的一些优选的实施方式中，所述室温核酸检测试剂盒还包含：1u/μl的rnase抑制剂，0.05u/μl的rnase h，四种rntp各2mm。

27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

28、本发明提供的用于室温检测rna的组合物可以在20～37℃范围内快速灵敏地检测到目标rna，能实现在20℃下30分钟内检测0.5cp/μl目标rna的能力。