基于抗生素抑制滚环扩增检测β-内酰胺酶耐药的新技术

本发明涉及生物检测，具体涉及一种基于抗生素抑制滚环扩增检测β-内酰胺酶耐药的技术。

背景技术：

1、随着抗生素的不断使用，细菌耐药性的发展日趋严重，开发有效的细菌耐药性检测方法有利于临床患者的治疗。目前临床上常使用青霉素类、头孢素类等β-内酰胺类抗生素，根据不同的耐药机制产生了不同的耐药检测方法。细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有3种：分泌β-内酰胺酶灭活抗生素，改变细胞膜的青霉素结合蛋白从而降低抗生素亲和力，降低细胞膜对抗生素的通透性。其中，分泌β-内酰胺酶灭活抗生素的机制最常见，在以上机制中占80%，广泛涉及到临床上重要的病原菌。

2、目前，对β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法主要包括基因检测和表型检测。基因检测是对细菌耐药基因进行检测，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,pcr）可以对耐药基因进行定性和定量，但pcr需要严格的温控装置和较长的检测时间，并且无法检测未知的耐药基因。除此之外，细菌的耐药表型与耐药基因型的一致性较弱，即使检测到耐药基因也不能准确判断细菌的具体耐药表型。表型检测是基于酶活性的检测方法，传统方法有头孢硝噻吩纸片法、纸片扩散法、肉汤稀释法等。头孢硝噻吩纸片法是临床实验室检测β-内酰胺酶的常用方法之一。头孢硝噻吩是β-内酰胺酶的显色底物，其中的β-内酰胺环被水解后纸片的颜色由黄转红。该方法操作简单，结果易观察，但只能起到定性的作用，并且检测能力较弱，当β-内酰胺酶浓度较低时检测时间从30 min延长至6 h，这大大提高了时间成本。纸片扩散法将定量的抗菌药物贴在含有待测菌的固体培养基上，通过抑菌圈可直观地对比细菌的耐药效果，但因为只能定性，所以通常被用来做药物敏感性试验，当进行细菌耐药性实验时要经过初筛、协同、确证等步骤，检测时间往往大于18 h，操作繁琐并存在污染的风险。肉汤稀释法将待测菌接种于不同浓度的抗菌药物稀释液中，可以定量分析最低抗菌浓度（mic）和最小杀菌浓度（mbc），但该方法操作繁琐、菌液培养时间长达16-20h，不利于实现快速定性定量检测的目标。

3、除了上述传统方法，新的β-内酰胺酶检测技术也在不断发展。例如，采用全基因组测序，能更加清晰地分析细菌耐药性基因型与表型之间的关系，这弥补了pcr检测的缺陷。但该方法还未完全成熟，标志物的筛选、数据库的开发仍需不断优化。质谱通过峰值变化直接检测β-内酰胺酶，是检测细菌耐药性最直接的方法，但该方法需要纯化并浓缩β-内酰胺酶，增加了时间和经济成本。

4、综上所述，β-内酰胺酶耐药性的传统检测方法以表型检测方法为主，但表型检测方法无法同时兼顾定量与快速，检测时间短的方法往往只能定性，定量的方法不得不增加检测时间。β-内酰胺酶耐药性的新检测技术还停留在尝试阶段，且成本较高。本发明以检测β-内酰胺酶活性为基本思路，旨在研发一种耗时短、成本低、能定量的β-内酰胺酶检测方法，为临床细菌耐药性检测开拓新思路。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有检测技术的缺点，以检测β-内酰胺酶活性为基本思路，提出了一种使用适配体和能被抗生素抑制的滚环扩增技术来检测β-内酰胺酶耐药的新方法。该方法首次提出使用适配体与滚环扩增技术检测青霉素酶，并将其扩展到对其他种类的β-内酰胺酶的检测，达到简单快速、低成本、定量检测细菌耐药性的目标。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

3、本发明提供了一种基于滚环扩增技术的线形单链模板dna，其特征在于，将β-内酰胺类抗生素特异性适配体序列引入滚环扩增的线形单链模板dna。

4、进一步地，所述线形单链模板dna的核酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步地，上述任一项所述线形单链模板dna在制备检测β-内酰胺类抗生素耐药性相关产品中的应用。

6、进一步地，上述任一项所述产品通过检测滚环扩增荧光强度，能确定是否存在β-内酰胺酶。

7、进一步地，上述任一项所述产品通过检测滚环扩增荧光强度的变化，能确定β-内酰胺酶浓度，荧光强度与β-内酰胺酶的浓度成反比。

8、本发明还提供了一种β-内酰胺类抗生素耐药性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述的基于滚环扩增技术的线形单链模板dna；所述β-内酰胺酶包括青霉素酶、头孢菌素酶、金属酶；所述β-内酰胺类抗生素包括氨苄西林钠、头孢噻肟。

9、进一步地，所述试剂盒还包括β-内酰胺类抗生素标准品、线形单链引物dna、dna聚合酶以及滚环扩增所需的酶反应体系；所述线形单链模板dna的核酸序列如seq id no.1所示；线形单链引物dna的核酸序列如seq id no.2所示。

10、进一步地，所述试剂盒使用方法具体步骤如下：

11、步骤一、将含有特异性适配体序列的线形单链模板dna制备成环形单链模板dna；

12、步骤二、将氨苄西林钠与待测样本混合，37 ℃孵育10 min，进行水解反应；

13、步骤三、向步骤二配制的水解体系中加入步骤一制得的环形单链模板dna、rcabuffer，室温孵育5 min后，加入线形单链引物dna、phi29、dntp、sybr green ii 37℃下进行滚环扩增反应，实时检测反应体系的荧光信号，激发波长498 nm，发射波长522 nm，每30s采集一次荧光信号，连续检测40 min。

14、进一步地，所述试剂盒使用方法具体步骤还包括：

15、步骤一、将含有特异性适配体序列的线形单链模板dna制备成环形单链模板dna；

16、步骤二、将氨苄西林钠与待测样本混合，37 ℃孵育10 min，进行水解反应；

17、步骤三、向步骤二配制的水解体系中加入步骤一制得的环形单链模板dna、rcabuffer，室温孵育5 min后，加入线形单链引物dna、phi29、dntp、sybr green ii、zn2+37℃下进行滚环扩增反应，实时检测反应体系的荧光信号，激发波长498 nm，发射波长522 nm，每30 s采集一次荧光信号，连续检测40 min。

18、进一步地，所述试剂盒使用方法具体步骤还包括：

19、步骤一、将含有特异性适配体序列的线形单链模板dna制备成环形单链模板dna；

20、步骤二、将头孢噻肟与待测样本混合，37 ℃孵育10 min，进行水解反应；

21、步骤三、向步骤二配制的水解体系中加入步骤一制得的环形单链模板dna、rcabuffer，室温孵育5 min后，加入线形单链引物dna、phi29、dntp、sybr green ii、37℃下进行滚环扩增反应，实时检测反应体系的荧光信号，激发波长498nm，发射波长522 nm，每30 s采集一次荧光信号，连续检测40 min。

22、本发明所述方法创造性地将抗生素特异性适配体引入滚环扩增的线形单链模板dna，形成含有类似“葫芦”二级结构的环形单链模板dna。当抗生素与适配体特异性结合后，dna聚合酶对线形单链引物dna的延伸受到阻碍，滚环扩增产物减少甚至消失。β-内酰胺酶的加入水解抗生素，导致抗生素与适配体的结合显著减弱，dna聚合酶对线形单链引物dna的延伸不再受到阻碍，滚环扩增成功启动。滚环扩增反应的抑制程度与抗生素的浓度成正比，与β-内酰胺酶的浓度成反比。通过分析含有β-内酰胺类抗生素的滚环扩增荧光强度值的变化，可以确定待测样本是否具有β-内酰胺酶耐药性及其耐药程度。

23、与现有技术比，本发明的有益效果如下。

24、1、操作简单，恒温反应。

25、2、快速便捷，成环后1 h即可完成检测。

26、3、定性和定量检测不同种类β-内酰胺酶的耐药性。

27、4、首次将“适配体-滚环扩增平台”的检测范围扩展到酶活性。