烟草多酚氧化酶NtPPO6及其编码基因、基因编辑载体和应用的制作方法

本发明涉及烟草多酚氧化酶ntppo6及其编码基因、基因编辑载体和应用，属于植物基因工程。

背景技术：

1、多酚氧化酶(ppo，polyphenol oxidase)是在自然界中广泛存在的一类铜结合酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。根据其底物的特异和作用机制，可分为三类：酪氨酸酶(ec 1.14.18.1)、儿茶酚氧化酶(ec 1.10.3.1)和漆酶(ec 1.10.3.2)。

2、多酚氧化酶具有多种功能：(1)参与了植物的生长和发育过程，如花朵开放、果实成熟和叶片的黄化等；(2)将植物中多酚类物质(如酪酸、儿茶酚等)转化为具有较高活性的氧化产物，如喹啉、喹啉醇等，这种氧化反应通常以分子氧为底物，产生的氧化产物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗肿瘤等；(3)多酚底物被ppo氧化，被认为是许多水果和蔬菜在收获、储存、运输和加工过程中棕色变色的主要原因，因此抑制多酚氧化酶的活性可以提高食品的保鲜性和品质；(4)多酚氧化酶还可以应用于环境保护领域，能够催化工业废水和水体中的有机物的氧化降解，从而减少水体污染；(5)多酚氧化酶还可以用于处理农药和有机污染物的土壤和废物。正是由于多酚氧化酶应用领域逐渐扩大，人们对多酚氧化酶的研究也越来越深入。

3、植物中的多酚氧化酶基因不仅功能复杂，而且多以基因家族的形式存在。目前研究者们在马铃薯、番茄、玉米、大豆、丹参、烟草等植物中均鉴定出多个多酚氧化酶，如在茄科经济作物茄子中找到6个ppo基因；番茄中发现7个ppo基因；马铃薯中有2个ppo基因。红三叶草中找到至少6个ppo基因，cai等发现高粱中存在8个不同的ppo基因，但葡萄藤中只发现一个ppo基因。而根据对普通烟草基因组数据库中序列同源性分析表明，烟草中多酚氧化酶基因可能有12～14个。申请公布号为cn107653256a的中国发明专利公开了一种烟草多酚氧化酶基因ntppo1及其定点突变方法与应用，具体公开了一种烟草多酚氧化酶基因ntppo1的核苷酸序列，并证明该多酚氧化酶基因ntppo1与烟草褐变相关。但是，由于烟草中多酚氧化酶基因功能复杂，目前对烟草多酚氧化酶基因家族的研究不够深入，多数的多酚氧化酶基因功能是未知的。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，以解决现有技术中烟草多酚氧化酶基因家族有部分成员未知的问题。

2、本发明的第二个目的是提供烟草多酚氧化酶ntppo6，以解决现有技术中烟草多酚氧化酶家族有部分成员未知的问题。

3、本发明的第三个目的是提供基因编辑载体，以解决现有技术中无合适的研究工具研究ntppo6基因功能的问题。

4、本发明的第四个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用，以解决现有技术中对烟草多酚氧化酶基因家族研究不够深入，而导致存在多酚氧化酶基因功能在烟草中未知的问题。

5、本发明的第五个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用，以解决现有技术中对烟草多酚氧化酶基因家族研究不够深入，而导致存在多酚氧化酶基因功能在烟草中未知的问题。

6、为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6所采用的技术方案是：

7、烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，其核苷酸序列为：

8、(1)seq id no.1所示的核苷酸序列；

9、或(2)seq id no.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

10、上述技术方案的有益效果在于：本发明在前期研究的基础上，以普通烟草不同时期叶片的cdna为模板，利用pcr技术，克隆获得了烟草多酚氧化酶的同源基因，命名为ntppo6。本发明通过对ntppo6基因的克隆、烟草多酚氧化酶ntppo6氨基酸序列分析、ntppo6基因的表达模式分析和ntppo6基因编辑烟草植株的构建发现，在烟草植株中敲除ntppo6基因后能显著降低叶片中多酚氧化酶的活性，说明其确实为多酚氧化酶基因家族成员。本发明发现的烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，丰富了烟草多酚氧化酶基因家族，为研究烟草中多酚氧化酶功能奠定基础。

11、为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶ntppo6所采用的技术方案是：

12、烟草多酚氧化酶ntppo6，其氨基酸序列为：

13、(1)seq id no.2所示的氨基酸序列；

14、或(2)seq id no.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。

15、上述技术方案的有益效果在于：本发明通过分析烟草多酚氧化酶ntppo6的氨基酸结构，预测其为烟草多酚氧化酶家族成员，通过构建ntppo6基因编辑烟草植株，通过检测其叶片中多酚氧化酶的活性，发现敲除ntppo6基因后，烟草叶片中多酚氧化酶的含量显著下降，证明了烟草多酚氧化酶ntppo6确实参与调控烟草中的多酚氧化酶活性。

16、为了实现上述目的，本发明基因编辑载体所采用的技术方案是：

17、基因编辑载体，所述基因编辑载体中包含根据ntppo6基因所设计的靶位点敲除序列，所述ntppo6基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

18、上述技术方案的有益效果在于：利用基因编辑技术，根据ntppo6基因设计敲除序列，构建基因编辑载体，转化烟草后，检测发现ntppo6基因成功敲除，说明本发明构建的基因编辑载体能有效敲除ntppo6基因，为后续该基因功能的研究提供良好的工具。

19、作为进一步地改进，依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：

20、ntppo6-c-f：5’-gattgtcccctactcttacacaatg-3’；

21、ntppo6-c-r：5’-aaaccattgtgtaagagtaggggac-3’。

22、为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用所采用的技术方案是：

23、烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用。

24、上述技术方案的有益效果在于：本发明通过基因编辑技术，构建基因编辑载体，转入烟草中，成功敲除ntppo6基因，获得ntppo6基因敲除的烟草植株。通过后续检测发现ntppo6基因敲除的烟草植株的叶片中绿原酸含量显著提高，为获得绿原酸含量增加的烟草品种奠定基础。

25、作为进一步地改进，在获得绿原酸含量升高的烟草品种中的应用。

26、为了实现上述目的，本发明烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用所采用的技术方案是：

27、烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用。

28、上述技术方案的有益效果在于：本发明通过构建ntppo6基因敲除的烟草植株，经观察发现ntppo6基因敲除后，烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。而烟草叶片较大，株高较高，造成其下部叶片透光性不是很良好，同时由于烟草叶片开片较大，也会影响烟田的通风情况。目前针对烟草株型尤其是节间性状育种的研究还比较少，而本发明证明ntppo6基因能调控烟草植物的株高、叶片数，这为通过改善烟草的透光性、通风性，最终提高烟草的光合利用率及烟草的总产量提供了一个重要的研究方向，为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供遗传材料和理论依据。本发明的烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6在植物株型育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

29、作为进一步地改进，抑制ntppo6基因的表达，烟草植株株高增加，平均叶片减少，中部最大叶宽、顶叶宽、顶叶长增加。