脂肪酶突变体及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程，涉及脂肪酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、维生素a棕榈酸酯具备良好的稳定性，因而成为维生素a常用的制剂形式，被广泛用于营养保健及动物饲料添加剂中。目前，市售维生素a棕榈酸酯主要通过化学法合成，反应过程复杂且条件苛刻，且容易产生异构体，给后续分离纯化造成困难。生物催化转化可以高效地解决化学合成法中存在的缺陷，因而极具应用价值。

2、例如，cn114854717a公开了蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)来源的脂肪酶wh-bc240及其突变体，通过其转酯活性或酯交换活性一步法高效催化维生素a棕榈酸酯的合成，催化转化维生素a醋酸酯合成维生素a棕榈酸酯反应生产效率可达564g l-1d-1，较难满足高生产需求；cn113957114a公开了一种酶法合成维生素a棕榈酸酯的方法，包括如下步骤：在有机溶剂中加入维生素a醋酸酯、棕榈酸、固定化酶进行酯交换反应，反应中还加入烷基氧离子咪唑盐和缚酸剂，所用固定化酶为脂肪酶；cn106544391a公开了酶催化制备维生素a棕榈酸酯的方法，包括以下步骤：1)将维生素a醋酸酯与棕榈酸低级脂肪醇酯溶解于有机溶剂中，加入脂肪酶；2)从冷凝器抽真空进行酶催化酯交换反应，经精馏柱分离出反应副产物乙酸低级脂肪醇酯及有机溶剂；3)反应料液经过滤除去脂肪酶，加入吸附剂进行吸附残留的棕榈酸低级脂肪醇酯，滤出维生素a棕榈酸酯溶液；4)减压蒸发有机溶剂，得到维生素a棕榈酸酯。

3、综上所述，在现有的脂肪酶参与的生物催化法制备维生素a棕榈酸酯技术路线中，仍然存在关键酶脂肪酶转酯反应生产效率较低的问题，限制了其在工业规模的应用。因此，通过基因组数据挖掘和定向进化等方法开发高催化效率的脂肪酶，绿色高效地合成维生素a棕榈酸酯具有重要的工业应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供脂肪酶突变体及其制备方法和应用，设计改造获得活性较高脂肪酶突变体，以期促进维生素a棕榈酸酯的生产。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：

4、(1)在seq id no:2所示序列基础上发生w180a和/或i240c突变的序列；或，

5、(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，

6、(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同一性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。

7、本发明中，基于来源于湖北拟酵母(pseudozyma hubeiensis)的脂肪酶phlipase(awx65616.1)进行设计改造，引入w180a和/或i240c突变，能够提高催化活性，进而提高维生素a棕榈酸酯的生产效率。

8、本发明中，在野生型脂肪酶中引入特定突变，获得脂肪酶突变体，能够提高其催化活性，可以理解，在所述脂肪酶突变体基础上，本领域技术人员能够利用本领域通用技术手段进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得功能相同或相似的其他序列。

9、在本发明一些具体实施方案中，除了引入w180a和/或i240c突变之外，还可以进一步在其他位点上进行氨基酸的保守取代。优选地，所述氨基酸的保守取代保留本发明脂肪酶突变体的底物特异性。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。最常见的氨基酸互换有氨基酸g至a；a至g，s；v至i，l，a，t或s；i至v，l或m；l至i，m或v；m至l，i或v；p至a，s或n；f至y，w或h；y至f，w或h；w至y，f或h；r至k，e或d；k至r，e或d；h至q，n，s；d至n，e，k，r或q；e至q，d，k，r或n；s至t或a；t至s，v或a；c至s，t或a；n至d，q，h或s；q至e，n，h，k或r的互换，以及它们的相反的互换。与上述脂肪酶突变体的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的脂肪酶突变体，优选地同源性为70％-99％之间，更优选地同源性为80％-99％之间，更优选地同源性为90％-99％之间，最优选地同源性为99％，也应属于本发明的保护范围。

10、seq id no:2：

11、mkftstitalaafvcvacatplvkrlpsgsdpafsvpqsqlaavlecqngspssqtnpillvpgtgvtgpqsfdsnwiplstqlgyspcwispppfmlndsqlnaeyivnavstlyagsgskkvpvltwsqgglatqwaltffpsirskvdrlmafapdykgtveaifltvpglasqsvwqqqaqsayltalqnaggltkivpttnlysalddivqpqvtnspadssylftakniqaqsicgptfvidhagsltsqfsyivgksalasgtgeaqssdysilncnplpadpltpqqkaeasglllvaganviagpkqncepdlkpyarryaigkktcsgvntgf。

12、第二方面，本发明提供核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的脂肪酶突变体。

13、本发明中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

14、优选地，所述核酸分子包括seq id no:3所示的序列，或与seq id no:3杂交且编码所述脂肪酶突变体的序列，或与seq id no:3具有90％以上的同一性且编码所述脂肪酶突变体的序列。

15、seq id no:3：

16、atgaagttcacctcgaccatcaccgcgcttgccgcattcgtctgtgttgcctgcgctacgcctctggtcaagcgactcccatctggctcggacccggccttctccgtcccacaatctcagctcgctgcagtgctcgagtgccagaacggctctccctcttcccagaccaaccccatcctgctcgttcccggcaccggtgttactggtcctcaatccttcgactcgaactggatccctctctccactcaactcggctactcgccatgctggatctcgccgcctcctttcatgctcaacgactcgcagctgaacgccgagtacattgtcaacgccgttagcacgctctacgccggctcaggttccaagaaggtgcccgtcctcacgtggtctcagggtggattggctactcagtgggcactgaccttcttccccagtattcgaagcaaggtcgatcgtttgatggccttcgctcccgactacaagggcaccgtggaagccatcttcctcaccgtcccgggtctggcaagtcaatcggtcgcccagcagcaggcccagtccgcttatctcaccgctcttcaaaatgctggtggtttgaccaagattgtccctaccaccaacctctacagtgccttggacgacattgttcagccacaggtcaccaactcgcccgccgactcgagctacctcttcaccgcgaagaacatccaggctcaatcgtgctgcggacccacgttcgtcatcgaccacgccggaagtcttacgtcgcagttttcgtacattgttggcaagtcggctcttgcttcgggtaccggcgaggctcagagcagcgactacagcatcctcaactgcaacccgcttcctgccgaccccctcactccccagcagaaagctgaggcttcgggtcttttgctcgtcgcgggcgccaatgtcatcgctggtcccaagcagaactgcgagcccgatctcaagccttacgccaggaggtacgctattggcaagaagacctgctccggtgtcaacaccggcttctaa。

17、第三方面，本发明提供重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。

18、本发明中，所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pet-26b(+)。

19、在一些实施方案中，所述重组载体为将所述核酸分子替换pet-26b(+)的ecori和hindiii酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。

20、第四方面，本发明提供重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的重组载体。

21、可以理解，所述重组细胞可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的基因可被有效表达即可。

22、进一步地，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌或黑曲霉等，具体如大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)，rosetta(de3)，bl21(de3)plyss，或m15等，优选为大肠杆菌bl21(de3)。

23、第五方面，本发明提供第一方面所述的脂肪酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：

24、将编码第一方面所述的脂肪酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，进行培养和分离纯化，得到所述脂肪酶突变体。

25、优选地，所述表达载体包括pet-26b(+)载体、prsfduet-1载体、petduet-1载体、pacycduet-1载体、ptrc99a载体或pet28a载体等。

26、优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌或黑曲霉等。

27、优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌rosetta(de3)，大肠杆菌bl21(de3)plyss或大肠杆菌m15等。

28、本发明中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离脂肪酶的方法均可采用本领域的常规方法。重组细胞表达脂肪酶时使用的培养基可以是本领域可使该重组细胞生长并产生本发明的脂肪酶突变体的培养基，例如lb培养基。

29、本发明中，培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使重组细胞正常生长，并表达脂肪酶突变体即可。

30、第六方面，本发明提供第一方面所述的脂肪酶突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组细胞或第五方面所述的脂肪酶突变体的制备方法在制备维生素a棕榈酸酯中的应用。

31、第七方面，本发明提供一种制备维生素a棕榈酸酯的方法，所述制备维生素a棕榈酸酯的方法包括：利用第一方面所述的脂肪酶突变体或第四方面所述的重组细胞催化维生素a醋酸酯进行转酯化反应，得到维生素a棕榈酸酯。

32、优选地，所述转酯化反应的温度为30～50℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、45℃、46℃、47℃、48℃或49℃等。

33、优选地，所述维生素a醋酸酯的终浓度为30～300g/l，例如30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、200g/l、300g/l，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，其中优选150g/l。

34、优选地，所述转酯化反应的原料还包括棕榈酸，添加量为维生素a醋酸酯的1.0～1.1倍当量，例如1.0、1.02、1.04、1.06、1.08、1.10倍当量，优选1.02倍当量。

35、优选地，所述转酯化反应的溶剂为本领域常规溶剂，如正庚烷。

36、在一些实施方案中，使用所述重组细胞催化维生素a醋酸酯进行转酯化反应，制备维生素a棕榈酸酯；具体地，可以使用所述重组细胞的冻干细胞作为催化剂进行全细胞催化生产维生素a棕榈酸酯，冻干细胞的用量为1.0-2.0g/l，可以为1.5g/l。冻干细胞是将重组细胞不经破碎直接冻干得到的。

37、应当理解的是，本发明所述的脂肪酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶突变体制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。

38、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

39、本发明通过理性设计，在来源于湖北拟酵母属的野生型脂肪酶中引入w180a和/或i240c突变，提高了脂肪酶的催化活性，能够提高维生素a棕榈酸酯的生产效率，可达815g·l-1·d-1，对于绿色高效地制备维生素a棕榈酸酯具有重要的工业应用价值。