一种用于幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因即时检测的LAMP检测用引物组及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种用于幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因即时检测的lamp检测用引物组及其应用。

背景技术：

1、幽门螺旋杆菌(hp)是一种螺旋形的微嗜氧细菌，已被证明与人类的许多消化道疾病有关，包括胃炎、十二指肠炎、消化性溃疡和胃癌根据一些流行病学调查。尽管hp感染的个体发生恶性肿瘤的风险较低，但hp已被iarc国际癌症研究机构列为第一组致癌物。

2、hp可以在宿主体内长时间存在而不表现出任何迹象或症状。一般来说，检测hp的诊断方法分为侵入性和非侵入性两大类。诊断hp感染可采用侵入性方法，如细菌培养(bc)、组织学和快速脲酶试验(rut)，以及非侵入性方法，如血清学、粪便抗原试验(sat)和尿素呼气试验(ubt)。虽然基于活检的检查有很好的诊断率，但这些技术也有其无法克服的不足，如费用高、转诊手续繁琐、手术风险大、患者严重不适。非侵入式测试主要分为两类。一种是直接检测，主要是通过直接检测hp存在的证据，如粪便抗原试验(sat)和尿素呼气试验(ubt)。另一种是间接检测，评估检测hp感染的间接证据，例如，感染hp的患者血清、唾液和尿液中抗体的存在，或通过呼吸中标记c同位素的量来测定脲酶活性。综上所述，现有的每一种诊断方法都有其方便性和局限性，其局限性可概括为对仪器要求较高、耗时较长、灵敏度较低、菌株难以分型。

3、分子检测法得到越来越多的关注，分子法可以包括在侵入性诊断与非侵入诊断两种方法之中，聚合酶链式反应(pcr)是应用最广泛的分子检测方法。有几种pcr的改进方法可以帮助提高检测的敏感性和特异性，包括实时pcr、嵌套式pcr，它可以快速检测和定量目标dna。然而，这种方法有几个缺点：设备成本高，技术水平高，由于不恰当的检测开发和不正确的数据分析导致的人为错误而增加假阴性结果的风险。

4、与pcr相比，lamp(loop-mediated isothermal amplification assay)需要bstdna聚合酶和一组4～6个引物，可以在恒温下完成，无需昂贵的热循环器。此外，lamp可在15～60min内扩增109倍目标序列副本。lamp的扩增能力比传统pcr高出10～100倍。amirsohrabi等已将利用高效lamp的poct方法检测hp，但该方法的不足在于荧光的污染，以及耐药基因检测的过程复杂，khotchawan bangpanwimon等利用比色磁吸法的lamp实验检测hp，该方法提高灵敏度，但实验过程繁琐，所用仪器复杂。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种用于幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因即时检测的lamp检测用引物组及其应用，针对hp的16s rrna、urea、vacam1、vacam2基因，分别设计了6条lamp引物，针对反应体系进行了一系列优化，与ph显色技术相结合，建立了特异的、高灵敏度的、快速的hp的多靶标低资源的poct检测方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种用于幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因即时检测的lamp检测用引物组，包括16s rrna、urea、vacam1、vacam2基因的引物组；

4、所述16s rrna基因的引物组包括内引物对16s-fip和16s-bip、外引物对16s-f3和16s-b3、环引物对16s-lf和16s-lb；其中，所述内引物对16s-fip和16s-bip的核苷酸序列如seq id no.1-2所示，所述外引物对16s-f3和16s-b3的核苷酸序列如seq id no.3-4所示，所述环引物对16s-lf和16s-lb的核苷酸序列如seq id no.5-6所示；

5、所述urea基因的引物组包括内引物对urea-fip和urea-bip、外引物对urea-f3和urea-b3、环引物对urea-lf和urea-lb；其中，所述内引物对urea-fip和urea-bip的核苷酸序列如seq id no.7-8所示，所述外引物对urea-f3和urea-b3的核苷酸序列如seq idno.9-10所示，所述环引物对urea-lf和urea-lb的核苷酸序列如seq id no.11-12所示；

6、所述vacam1基因的引物组包括内引物对vacam1-fip和vacam1-bip、外引物对vacam1-f3和vacam1-b3、环引物对vacam1-lf和vacam1-lb；其中，所述内引物对vacam1-fip和vacam1-bip的核苷酸序列如seq id no.13-14所示，所述外引物对vacam1-f3和vacam1-b3的核苷酸序列如seq id no.15-16所示，所述环引物对vacam1-lf和vacam1-lb的核苷酸序列如seq id no.17-18所示；

7、所述vacam2基因的引物组包括内引物对vacam2-fip和vacam2-bip、外引物对vacam2-f3和vacam2-b3、环引物对vacam2-lf和vacam2-lb；其中，所述内引物对vacam2-fip和vacam2-bip的核苷酸序列如seq id no.19-20所示，所述外引物对vacam2-f3和vacam2-b3的核苷酸序列如seq id no.21-22所示，所述环引物对vacam2-lf和vacam2-lb的核苷酸序列如seq id no.23-24所示。

8、一种用于幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因即时检测的试剂盒，包括上述的lamp检测用引物组。

9、优选地，所述16s rrna、urea、vacam1、vacam2基因的引物组中，引物对的浓度比和终浓度均相同；其中，浓度比为内引物对：环引物对：外引物对＝8:4:1；所述内引物对的终浓度为1.6μmol/l，所述环引物对的终浓度为0.8μmol/l，所述外引物对的终浓度为0.2μmol/l。

10、优选地，还包括bst dna聚合酶、lamp反应液、苯酚红、阳性对照和阴性对照。

11、优选地，所述lamp反应液包括10×反应缓冲液、100mm mgso4、10mm dntps。

12、一种幽门螺杆菌的lamp荧光-显色双重检测方法，包括以下步骤：

13、步骤1)提取待测样品dna；

14、步骤2)以提取的dna为模板，配制25μl反应体系，所述反应体系包括上述的lamp检测用引物组、bst dna聚合酶、lamp反应液、待测样品dna、lamp专用荧光染料和/或苯酚红，用ddh2o定容至25μl，同时设置无菌ddh2o作为阴性对照；

15、步骤3)将步骤2)所述反应体系进行lamp扩增，于60～68℃恒温或金属浴中反应1h，反应结束后于85℃加热5min，使酶失活终止反应，得到lamp扩增曲线和/或显色变化；

16、步骤4)结果判定：扩增曲线ct值小于40为阳性，ct值大于40为阴性；显色反应由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。

17、优选地，步骤1)所述待测样品为胃液。

18、本发明的有益效果如下：

19、本发明利用lamp荧光-显色双重方法能够检测到h.pylori最低浓度为10-6ng/μl，其灵敏度较高，是常规pcr反应的10倍。lamp荧光-显色双重方法是利用dna插层染料与ph指示剂相结合，根据扩增曲线和反应体系的颜色变化，判断阳性结果。本发明具有以下优点：(1)核酸处理过程只需2min，无需复杂的移液操作，可从样本直接到结果；(2)反应速度快，实现样本到结果45min；(3)灵敏度高；(4)可视化；(5)无需开盖读取结果；(6)可多靶标、高通量。本发明的检测方法不需要开盖实现样本到结果的快速检测，本方法可对hp进行定性以及毒力分型，可做高通量多靶标的检测，标本随到随做，无需昂贵的仪器，可实现基层医院的poct的检测。