一种脐带间充质干细胞的制备方法及其应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法及其应用。

背景技术：

1、人源脐带干细胞(umbilical cord derived stem cells，ucscs)是近年来从人脐带组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。ucscs不仅可以定向分化为脂肪、软骨、心肌细胞等多种细胞；还可分泌多种促进血管生成因子、凋亡因子等多种具有生物学活性的细胞因子。此外，脐带属于围产组织，ucscs具有取材容易、获取量大、不会对供体产生任何副作用等优点。目前已被广泛应用于组织工程及再生医学领域。研究结果显示，间充质干细胞(mscs)mscs不仅可以分化成新神经元，来修复卒中后的脑组织，还可通过调节神经组织的微环境，减轻卒中区的炎症反应，促进神经血管修复以及血管再生、神经发生、等，通过减少梗死面积和减轻血脑屏障破坏的作用。

2、目前，大部分体外培养的干细胞是在21％常氧条件下进行，而人体正常组织的氧含量为3％～10％，器官氧含量为1％～5％，骨髓腔内氧含量为1％～7％，动脉血氧含量为12％，静脉血氧含量为5％，因此传统间充质干细胞体外培养氧环境不能真正模拟体内干细胞的氧环境，但大量的研究表明，间充质干细胞移植后存活率明显下降，移植后24小时内，超过90％的干细胞发生坏死或凋亡，这些均严重影响了干细胞的应用疗效。如何解决间充质干细胞移植的存活性，成为疾病治疗的首要难点。

3、卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment，psci)是指在卒中事件后出现并持续到6个月时仍存在的以认知损害为特征的临床综合征。psci按照认知受损的严重程度，可分为卒中后认知障碍非痴呆(post-stroke cognitive impairment nodementia，pscind)和卒中后痴呆(post-stroke dementia，psd)。二者均有至少一个认知域受损，区别在于psd患者生活、工作能力严重受损，而pscind患者生活和工作能力可完全正常或轻度受损。随着国内人口老龄化日益加剧，psci发病率高达53.1％。同时，psci的致残率增加，患者的生活质量、自理能力、心理健康状况显著下降，家属照顾压力和社会疾病治疗负担骤增，亟需相应的治疗手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种脐带间充质干细胞的制备方法及其应用为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

2、第一方面，本发明提供一种含药血清培养基，所述培养基包括条件培养基和含药血清；所述含药血清为用中药组方提取物灌胃处理大鼠的血清；所述中药组方按重量份包括以下成分：黄芪20-40份、人参5-7份、何首乌10-20份、当归10-20份、天麻5-7份、远志5-7份、巴戟天10-20份、法半夏5-7份、石菖蒲5-7份。

3、本发明的中药组方，通过各个中药的合理配伍，能够有效对卒中后认知障碍进行治疗。其中，方中以人参(生晒参)为“君药”，起到大补元气的作用；以黄芪、当归、制何首乌、巴戟天起增补气血之功用，有益精髓之力，作为“臣药”。而黄芪、当归、天麻、法半夏、菖蒲、远志进行配伍，又能够起到益气通脉、补血活血、豁痰通络的辅佐效果；石菖蒲和远志具有豁痰开窍、宣通神机的功效。本发明利用中药成分和静脉内皮细胞分泌的外泌体，对脐带间充质干细胞的成血管能力进行“诱导”；经低氧和含药血清诱导处理后的脐带间充质干细胞，其定向分化为脂肪、软骨、心肌细胞等多种细胞的能力增强。

4、更优选地，所述中药组方按重量份包括以下成分：黄芪30份、人参6份、何首乌15份、当归15份、天麻6份、远志6份、巴戟天15份、法半夏6份、石菖蒲6份。

5、作为本发明所述培养基的优选实施方式，所述条件培养基和含药血清的体积比为条件培养基：含药血清＝1：(0.2-0.3)。

6、作为本发明所述培养基的优选实施方式，所述中药组方提取物的制备包括以下步骤：称取中药组方，加入1000-1200ml的水，浸泡25-30min后大火煮沸，随后小火煎煮至500-600ml并趁热过滤，浓缩滤液获得中药组方提取物。

7、作为本发明所述培养基的优选实施方式，所述中药组方提取物的浓度为132.3mg/ml。

8、作为本发明所述培养基的优选实施方式，所述含药血清的制备包括以下步骤：用含中药组方的提取物对大鼠进行灌胃处理，结束后对大鼠进行采血处理，纯化后得到含药血清；所述灌胃处理的频率为每天3次，连续7天；所述灌胃处理中，中药组方提取物的用量为5ml/次。本发明通过优选上述灌胃处理的频率，能够进一步提高中药小分子在大鼠血清中的浓度。

9、作为本发明所述培养基的优选实施方式，所述采血处理包括以下步骤：在灌胃处理末次给药1h后，麻醉大鼠并在腹主动脉采血，得到含药原血；将含药原血室温静置2h后，在3500r/min，4℃下离心10min，分离血清，在56℃热处理30min进行灭活，0.22um滤膜过滤，得到含药血清。

10、作为本发明所述培养基的优选实施方式，所述条件培养基的制备方法为：用完全培养基培养脐带静脉内皮细胞p3代细胞24-56h后，分离培养体系上清，得到条件培养基。所述脐带静脉内皮细胞用完全培养基进行传代培养，培养至48-56h时，脐带静脉内皮细胞会分泌外泌体，所述外泌体位于培养上清中。脐带静脉内皮细胞分泌的外泌体中，包含了生长因子、细胞因子、蛋白质等。这些营养因子可以促进细胞的生长、增殖和分化，维持细胞的正常功能。

11、因此，将脐血静脉内皮细胞经过48h分泌外泌体的条件培养基作为基础成分，复合“含复方中药成份”的血清作为ucscs的细胞培养体系，协同低氧培养的条件，既能够提供间充质干细胞培养所需的营养成分，同时能够模拟人体服食中药后，间充质干细胞收到中药药物成分的诱导后分化能力增强的效果。经过该培养方式，制备的间充质干细胞，应用于卒中后认知障碍的治疗时，能够通过其分化能力多水平调控血管内皮细胞的致密程度，同时易于透过脑血屏障，改善脑梗区(缺血缺氧区)的脑组织的情况。

12、第二方面，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

13、(1)脐带间充质干细胞原代培养和传代培养：分离脐带中的沃顿胶，原代培养后分离脐带间充质干细胞，继续传代培养，得到p3-p5代的脐带间充质干细胞；

14、(2)含药血清低氧处理：取步骤(1)所述的p3-p5代的脐带间充质干细胞，在低氧条件下用含药血清培养基培养至细胞融合率为90％，收集并重悬细胞，得到分化能力增强的脐带间充质干细胞。本发明利用含药血清培养基培养脐带间充质干细胞，模拟人体服食中药后，诱导间充质干细胞成血管能力的效果。

15、作为本发明所述方法优选的实施方式，步骤(1)中，所述脐带间充质干细胞原代培养具体包括以下步骤：取健康足月剖腹产婴儿的脐带，清洗后剥离脐带羊膜和1条动脉和2条静脉，取出沃顿胶；将沃顿胶剪碎至1-3cm3，用完全培养基重悬后接种至t75培养瓶中培养2天，培养至第2天时补充完全培养基，培养至第5天时进行换液处理；所述换液处理为用完全培养基重悬后接种至t75培养瓶中直至细胞爬出，弃去组织块，补充完全培养基继续培养，培养细胞至形成较大克隆，得到可传代的p0代脐带间充质干细胞。本发明通过剥离脐带的羊膜和血管等非目标组织，保证了细胞源性的纯度，避免了血管内皮细胞的污染。同时，所选用的完全培养基专为脐带来源的间充质干细胞特别开发，连续传代依然保持间充质干细胞的表面特征稳定。

16、作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述脐带间充质干细胞的传代培养具体包括以下步骤：取原代培养获得的p0代脐带间充质干细胞进行重复传代处理后，得到扩增至p3-p5代的脐带间充质干细胞；所述传代处理依次包括清洗、消化、吹打离心、重悬培养步骤；待重悬培养至细胞融合时，重复消化、吹打离心和重悬步骤2-5次，得到扩增至p2-p5代的脐带间充质干细胞。

17、进一步地，所述传代处理具体包括以下步骤：

18、(2a)取可传代的p0代脐带间充质干细胞用生理盐水清洗2-3次；

19、(2b)向步骤(2a)中清洗后的p0代脐带间充质干细胞中加入0.25％胰蛋白酶进行消化；待显微镜下观察细胞间隙增大，胞质回缩且长梭形细胞变圆变亮时，加入10倍细胞体积的完全培养基终止消化；

20、(2c)反复吹打步骤(2b)终止消化后的脐带间充质干细胞，直至全部脱落成单细胞悬液，将悬液离心；离心条件为1500rpm，5min；

21、(2d)弃去步骤(2c)的上清液，加入完全培养基重悬细胞，按1×105cells的密度在5％co2，37℃，饱和湿度的环境中进行脐带间充质干细胞传代培养；

22、(2e)待细胞生长至融合时，以步骤(2b)至(2d)为一个传代周期重复操作2-5次进行细胞扩增，得到扩增至p2-p5代的脐带间充质干细胞。

23、作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中所述的原代培养和传代培养均在t75培养瓶中进行，细胞培养环境为：35℃-38℃、4％-6％ co2，饱和湿度；步骤(1)中操作均为无菌操作。优选的，细胞培养环境为37℃，5％ co2，饱和湿度。

24、作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述p3-p5代的脐带间充质干细胞以1×105cells的密度接种至含药血清培养基培养中。

25、作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述低氧条件为细胞在氧气含量为1％-3％进行培养。更优选的，所述氧气含量为2％。

26、氧气是影响间充质干细胞(mscs)增殖作用的关键因素，常规细胞体外培养的氧气体积分数约为21％，co2体积分数约为5％，而人体正常组织和组织间隙中的氧气体积分数为3％-9％。因此，本发明通过模拟人体中低氧细胞环境，提高间充质干细胞的增殖能力；另一方面，在低氧条件下培养间充质干细胞，能够同时增强间充质干细胞(msc)营养因子的表达和分泌，包括生长因子，如血管内皮生长因子(vegf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、肝细胞生长因子(hgf)、转化生长因子β1(tgf-β1))、胰岛素样生长因子1(igf-1)、成纤维细胞生长因子10(fgf10)和表皮生长因子(egf)；细胞因子，如il-6、il-8、趋化因子配体20(ccl-20)和单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)；以及基质调节剂如血管生成素、金属蛋白酶-1(timp-1))和金属蛋白酶(mmp)的组织抑制剂。

27、本发明的间充质干细胞制备方法，低氧环境模拟培养能够提高间充质干细胞体外培养的存活率；同时利用含药血清培养脐带间充质干细胞，诱导间充质干细胞的分化能力(包括成血管能力，成骨能力，成脂肪能力)增强，进一步起到模拟人体服食中药后，间充质干细胞与药物成分两者协同起效的效果；本发明的制备方法简单、操作容易，对于仪器设备的要求不高，普通的超净台、低速离心机和摇床即可满足要求，更利于规模化生产制备应用于药物制备的间充质干细胞。

28、第三方面，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的制备方法在制备治疗卒中后认知障碍药物中的应用。

29、脐带间充质干细胞不仅可以定向分化为脂肪、软骨、心肌细胞等多种细胞；还可分泌多种促进血管生成因子、凋亡因子等多种具有生物学活性的细胞因子。通过本发明制备方法制备获得的分化能力增强的脐带间充质干细胞，可以分化成新神经元，来修复卒中后的脑组织，还可通过调节神经组织的微环境，减轻卒中区的炎症反应，促进神经血管修复以及血管再生、神经发生、等，通过减少梗死面积和减轻血脑屏障破坏的作用。

30、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述治疗卒中后认知障碍药物中脐带间充质干细胞的浓度为1×106cells/ml-1×107cells/ml。

31、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述治疗卒中后认知障碍药物的给药方式为注射给药；所述注射给药的频率为0.1-1.0ml/次/周，连续3-5周进行给药；所述注射给药的部位为大脑侧室。

32、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

33、1.本发明提供一种脐带间充质干细胞的制备方法，该方法操作简易，对于仪器设备的要求不高，普通的超净台、低速离心机和摇床即可满足要求，更利于规模化生产制备。同时通过剥离脐带的羊膜和血管等非目标组织，保证了细胞源性的纯度，避免了血管内皮细胞的污染。使用不含动物源性血清的细胞培养体系，并添加“含中药成份”对细胞间充质干细胞进行低氧培养，既能够提供间充质干细胞培养所需的营养成分，同时能够模拟人体服食中药后，间充质干细胞收到中药药物成分的诱导后分化能力增强的效果。

34、2.本发明提供的中药组方，其中方中以人参(生晒参)为“君药”，起到大补元气的作用；以黄芪、当归、制何首乌、巴戟天起增补气血之功用，有益精髓之力，作为“臣药”。而黄芪、当归、天麻、法半夏、菖蒲、远志进行配伍，又能够起到益气通脉、补血活血、豁痰通络的辅佐效果；石菖蒲和远志具有豁痰开窍、宣通神机的功效。本发明利用含有中药成分的血清，和静脉内皮细胞分泌的外泌体，对脐带间充质干细胞的成血管能力进行“诱导”。

35、3.本发明提供的应用中，将经过含药低氧处理后的，分化性能增强的脐带间充质干细胞应用于制备治疗卒中后认知障碍药物中，利用脐带间充质干细胞的分化能力，通过调节神经组织的微环境，容易透过脑血屏障，改善脑梗区(缺血缺氧区)的脑组织的情况，与患者所服用的药物成分协同对卒中后认知障碍进行治疗。