双歧杆菌分离培养方法与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及双歧杆菌分离培养方法。

背景技术：

1、双歧杆菌（ bifidobacterium）属于放线菌门双歧杆菌科，是革兰氏阳性，厌氧，最适生长环境为37℃，ph为6.0-7.0。双歧杆菌在显微镜下，常为弯曲的杆状、l、v或者y型等多种形态，末端常常分叉，其菌落呈光滑、瓷白色或白色凸起。目前研究较为广泛的双歧杆菌主要包括两双歧杆菌（ bifidobacterium bifidum）、青春双歧杆菌（ bifidobacterium  adolescentis）、长双歧杆菌（ bifidobacterium longum）、短双歧杆菌（ bifidobacterium  breve）、婴儿双歧杆菌（ bifidobacterium infantis）以及动物双歧杆菌（ bifidobacterium  animalis）。

2、双歧杆菌具有严格厌氧的特性，使其在实验室中的培养并不理想，从自然环境、益生菌食品、动物、人体中分离双歧杆菌具有几种常见的培养基类型，包括：（1）mrs培养基，其为双歧杆菌菌株常规培养和复苏的首选培养基。（2）tpy培养基，是用途广泛的商业培养基，其允许大多数双歧杆菌物种生长，被推荐作为已知双歧杆菌物种的选择性培养基。（3）bl培养基可以对乳制品和肠道中的双歧杆菌进行非选择性计数，但是非选择性意味着能分离出其他细菌，对双歧杆菌的筛选有一定的困难。（4）tos-mup是商业上可用的双歧杆菌选择性琼脂培养基，可以选择性地计数发酵牛奶中常用的双歧杆菌。

3、中国专利cn115216410a中公开了一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，采用的培养基是以tpy培养基为基础进行改良的选择性培养基。所述的改良tpy包括抗生素莫匹罗星、生物调控因子a、显色剂x-gal和生长调控因子b。该发明的改良tpy能选择性地抑制粪便样品中的革兰氏阴性菌，且对双歧杆菌的生长具有促进作用，使得其在平板表面生长出显蓝色的典型菌落，可显著降低复杂混合样品中双歧杆菌的分离难度，对双歧杆菌的筛选培养具有实用价值。

4、中国专利cn109136145a中公开了一种从兔粪中分离双歧杆菌及其纯化方法，包括以下步骤：步骤一：制备样品液；步骤二：稀释样品液；步骤三：分离培养；步骤四：制备纯化培养基；步骤五：纯化培养。该发明通过分离培养提高了菌种的纯化，解决了现有分离出的双歧杆菌活菌量较低的问题；通过对纯化培养基进行优化，有效的缩短了培养时间，解决了现有培养时间较长成本高，效率较低的问题。

5、双歧杆菌难以从人体肠道中分离出的原因是肠道微生物是一个复杂而庞大的系统，微生物的种类非常多，使用非选择性的培养基不但可以分离出双歧杆菌属的细菌，还能够分离出大量不属于双歧杆菌属的细菌，使得工作量较大但分离效果较差，并且其他微生物可能与双曲杆菌属的细菌争夺营养物质，导致双歧杆菌属的细菌的存活率下降。并且，双歧杆菌属的细菌对氧气非常敏感，使得其在常规大气条件下的存活时间较短。因此，目前需要一种分离双歧杆菌效果较高的分离方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供双歧杆菌分离培养方法，具有较好的分离效果。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种从成人粪便中分离双歧杆菌的方法，包括以下步骤：

4、（1）将成人粪便样本加入富集培养基，厌氧培养，得到富集培养液；

5、（2）将富集培养液进行梯度稀释，得稀释液；

6、（3）将稀释液涂布于筛选培养基中，厌氧培养，得初筛菌；

7、（4）挑取双歧杆菌单菌落，接种于液体增菌培养基中，厌氧培养，得双歧杆菌；

8、步骤（3）中所述的筛选培养基按照重量份数计包括蛋白胨20-30份、可溶性淀粉0.1-10份、氯化钠1-10份、琼脂5-15份、5-15份无菌脱纤维羊血和0.01-1份盐酸头孢吡肟；

9、步骤（3）中所述厌氧培养的时间为48-72h。

10、优选地，步骤（3）中所述的筛选培养基按照重量份数计包括蛋白胨23份、可溶性淀粉1份、氯化钠5份、琼脂10份、5份无菌脱纤维羊血和0.02份盐酸头孢吡肟。

11、进一步地，所述的蛋白胨为特殊蛋白胨。

12、根据本发明的一些实施方式，所述的筛选培养基包括特殊蛋白胨23g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、琼脂10g、5%无菌脱纤维羊血和0.02mg盐酸头孢吡肟。

13、进一步优选地，步骤（1）中所述的成人粪便样本的接种量为1.5-2%。

14、进一步优选地，步骤（1）中所述的富集培养基按照重量份数计包括：蛋白胨5-15份、葡萄糖10-30份、酵母浸粉1-10份、牛肉膏5-15份、k2hpo41-5份、柠檬酸二铵1-5份、乙酸钠1-10份、mgso4·7h2o 0.1-1份、mnso4·4h2o 0.1-1份、吐温80 1-10份和0.1-5份l-半胱氨酸。

15、再进一步优选地，所述的富集培养基包括蛋白胨10份、葡萄糖20份、酵母浸粉5份、牛肉膏10份、k2hpo42份、柠檬酸二铵2份、乙酸钠5份、mgso4·7h2o 0.58份、mnso4·4h2o0.25份、吐温80 1份和0.5份l-半胱氨酸。

16、优选地，所述的富集培养基的ph为6-8。

17、进一步优选地，所述的富集培养基的ph为7.0±0.1。

18、优选地，步骤（1）中所述的厌氧培养的时间为18-24h。

19、进一步优选地，步骤（1）中所述的厌氧培养的时间为24h。

20、优选地，步骤（2）中生理盐水的配制包括以下步骤：称取氯化钠8.5g，加热溶解于1l蒸馏水中，分装于试管中，121℃高压灭菌20min。

21、优选地，步骤（2）中所述的梯度稀释具体为：吸取1份富集培养液加入9份生理盐水，混匀，记为10-1稀释梯度，从10-1梯度中吸取1份混合液加入9份生理盐水，记为10-2稀释梯度，重复上述稀释步骤，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6稀释液。

22、优选地，步骤（3）中厌氧的条件为90%n2、5%co2、5%h2。

23、优选地，步骤（3）中厌氧培养的时间为72h。

24、优选地，步骤（3）中厌氧培养的温度为30-38℃。

25、进一步优选地，步骤（3）中厌氧培养的温度为36-38℃。

26、优选地，步骤（3）中所述的筛选培养基的ph为6-8。

27、进一步优选地，步骤（3）中所述的筛选培养基的ph为7.3±0.2。

28、进一步地，步骤（4）中所述的液体增菌培养基包括：脑心浸液肉汤粉末30-40份、0.01-1%的氯化血红素和0.01-1%的维生素k1。

29、更进一步地，步骤（4）中所述的液体增菌培养基包括：脑心浸液肉汤粉末38.5份、0.01%的氯化血红素和0.01%的维生素k1。

30、优选地，步骤（3）得到初筛菌后还包括菌株纯化的步骤。

31、进一步优选地，所述的菌株纯化为：从计数范围在30-300的培养基平板上，挑取双歧杆菌单菌落，分别三区划线于筛选培养基平板上，放置于30-38℃条件下厌氧培养48-72h。

32、优选地，所述的双歧杆菌包括但不限于长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、两双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌亚种、假小链双歧杆菌。

33、进一步优选地，所述的双歧杆菌包括但不限于长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、两双歧杆菌。

34、优选地，所述的双歧杆菌的活化包括：按1-10%接种量将双歧杆菌接种至液体增菌培养基进行活化。

35、进一步地，所述的接种量为5%。

36、根据本发明的一些实施方式，从成人粪便中筛选双歧杆菌的方法包括以下步骤：

37、（1）富集培养：将成人粪便样本加入到mrs液体培养基中，于36-38℃条件下厌氧培养18-24h，得到富集培养液；

38、（2）梯度稀释：吸取1份富集培养液加入9份生理盐水，混匀，记为10-1稀释梯度，从10-1梯度中吸取1份混合液加入9份生理盐水，记为10-2稀释梯度，重复上述稀释步骤，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；

39、（3）涂布培养：吸取步骤（2）中的稀释液涂布于筛选培养基中，36-38℃条件下厌氧培养48-72h；

40、（4）菌株纯化：从计数范围在30-300的培养基平板上，挑取双歧杆菌单菌落，分别三区划线于筛选培养基平板上，放置于36-38℃条件下厌氧培养48-72h；

41、（5）单菌扩大培养：挑取单菌落，接种于液体增菌培养基中，36-38℃厌氧培养24-48h，得双歧杆菌。

42、优选地，所述的双歧杆菌的鉴定方法选自its、18s、28s、测序、pcr鉴定中的任意一种。

43、进一步地，所述的双歧杆菌的鉴定方法为pcr鉴定。

44、优选地，所述的pcr鉴定包括使用双歧杆菌特异性引物进行菌落pcr。

45、进一步地，所述的特异性引物包括bif164-f和bif662-r；所述的bif164-f的序列如seq id no:1所示，所述的bif662-r的序列如seq id no:2所示。

46、具体地，seq id no:1的序列为gggtggtaatgccggatg；seq id no:2的序列为ccaccgttacaccgggaa。

47、优选地，所述的pcr的反应体系为25μl反应体系，包括dna模板1μl、pcr预混液12.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl，加水至25μl。

48、优选地，所述的pcr的反应程序为：94℃，5min，循环1次；94℃，30s，54℃，40s，72℃，90s，循环35次；72℃，10min，循环1次。

49、又一方面，本发明提供了上述的方法在鉴定、分析双歧杆菌中的应用。

50、本发明的有益效果为：

51、本发明提供的从成人粪便中筛选双歧杆菌的方法解决了从人体粪便中筛选双歧杆菌困难的问题，提高了人体粪便中筛选双歧杆菌的效率。