一种捕获区域不等深的二代测序方法与流程

本发明涉及精准医疗，尤其是二代测序检测肿瘤变异方面，具体为一种捕获区域不等深的二代测序方法。

背景技术：

1、捕获测序是肿瘤检测的常用手段，通过生物素化探针与靶标分子杂交，经过一系列清洗过程，最终富集目的区域。而在一些应用过程中，不同目标区域需要不同的覆盖深度，如热点加深或低深度snp检测等。传统方法通过调节区域探针浓度比例或将不同区域探针分开各自杂交实现。而由于探针对于靶标分子来说都是远远过量的，调节探针比例只能小幅度影响区域深度，效果并不理想。而分开杂交增加试剂成本及时间成本十分不方便。

2、区域不等深杂交，目前主要通过两种方式进行：

3、1. 以一定比例混合靶向不同区域的探针，低深度区域占比低，高深度区域占比高；

4、2. 将靶向不同区域的探针，分别进行杂交反应，然后各自测不同数据量，低深度少测，高深度多测。这两种方法各有缺点，第一种方法由于探针对于靶标来说远远过量，降低靶向低深度区域探针，不能有效降低区域深度，相对而言也无法有效提高高深度区域深度，一般最大只能达到约1.5-2倍的深度差，实际应用过程中作用有限。对于第二种方法，分开杂交虽然能有效的制造深度差异，但要增加一倍的试剂成本与人员操作成本，造成实际操作困难。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、本发明利用链霉亲和素先封闭一定比例的需要降低区域深度的生物素化探针，然后和需要加深区域的普通生物素化探针进行一定比例混合，从而达到区域不等深的目的。

3、（二）技术方案

4、基于此，本发明提供如下技术方案：一种捕获区域不等深的二代测序方法，测序方法具体步骤如下：

5、步骤s1：核酸提取，片段化，具体为，提取dna双链核酸，提取dna双链核酸后进行片段化处理：

6、步骤s2：末端修复，加a尾，具体为，在末端添加突出的a碱基，可以产生黏性末端；

7、步骤s3：接头连接，接头纯化，具体为，与含有t末端的接头进行互补配对，同时进行接头纯化，增加接头的主要目的是为了在片段dna的末端增加文库的标签和可以和测序平台互补的寡核苷酸序列；

8、步骤s4：index pcr，纯化，定量，具体为，使用和接头互补的引物对其进行扩增，中间再穿插着纯化、定量步骤，从而完成文库的构建；

9、步骤s5：杂交孵育，具体为：将预文库等分成多份进行杂交实验是在摸索封闭的探针比例。实际使用过程中不需要将预文库进行等分，直接杂交封闭好的探针即可，进行杂交实验，在杂交实验前实验组先进行链霉亲和素封闭探针操作，所用探针为双链120bp生物素化杂交捕获探针；

10、将链霉亲和素用te 缓冲液稀释100倍，与靶向低深度区域探针-a混匀，孵育，然后分别加入靶向高深度区域探针-b ，混合均匀作为实验组杂交捕获探针，封闭过程只需要做一次即可，一次封闭的探针可以够几百次反应用量，之后可以一直使用；

11、步骤s6：漂洗，洗脱；

12、步骤s7：进行聚合酶链式反应；

13、步骤s8：定量、上机测序。

14、（三）有益效果

15、与现有技术相比，本发明提供了一种捕获区域不等深的二代测序方法，具备以下有益效果：

16、该一种捕获区域不等深的二代测序方法，利用链霉亲和素先封闭需要降低区域深度的生物素化探针，然后和需要加深区域的普通生物素化探针进行一定比例混合，从而达到区域不等深的目的，不仅可以使两个区域原始深度形成差异，并且可以形成有效深度大幅差异，同时减少了试剂成本与人员操作成本，操作方便快捷。

技术特征：

1.一种捕获区域不等深的二代测序方法，其特征在于：测序方法具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种捕获区域不等深的二代测序方法，其特征在于：如上所述步骤s1具体为，提取dna双链核酸，提取dna双链核酸后进行片段化处理。

3.根据权利要求1所述的一种捕获区域不等深的二代测序方法，其特征在于：如上所述步骤s2具体为，在末端添加突出的a碱基，可以产生黏性末端。

4.根据权利要求1所述的一种捕获区域不等深的二代测序方法，其特征在于：如上所述步骤s3具体为，与含有t末端的接头进行互补配对，同时进行接头纯化。

5.根据权利要求1所述的一种捕获区域不等深的二代测序方法，其特征在于：如上所述步骤s4具体为，使用和接头互补的引物对其进行扩增，中间再穿插着纯化、定量步骤，从而完成文库的构建。

6.根据权利要求1所述的一种捕获区域不等深的二代测序方法，其特征在于：如上所述步骤s5具体为：将预文库等分为多份，进行杂交实验，在杂交实验前实验组先进行链霉亲和素封闭探针操作，所用探针为双链120bp生物素化杂交捕获探针。

技术总结
本发明涉及一种捕获区域不等深的二代测序方法，测序方法为：提取DNA双链核酸，提取DNA双链核酸后进行片段化处理，在末端添加突出的A碱基，连接截短型接头，使用带有index引物PCR形成预文库。本发明利用链霉亲和素先部分封闭需要降低区域深度的生物素化探针，然后和需要加深区域的普通生物素化探针进行一定比例混合，从而达到区域不等深的目的，不仅可以使两个区域原始深度形成差异，并且可以形成有效深度大幅差异，同时减少了试剂成本与人员操作成本，操作方便快捷。

技术研发人员：张怡然,王冰,商宇红,郝艳同,陈慧娟,周启明
受保护的技术使用者：北京求臻医疗器械有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6