两种孢子蛋白稳定融合表达非洲猪瘟关键抗原的重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及两种孢子蛋白稳定融合表达非洲猪瘟关键抗原的重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)又称东非猪瘟或疣猪病，由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起猪的急性、热性、出血性和高度接触性传染病。感染asfv的患病猪，其临床症状及病理变化与猪瘟相似，可出现精神沉郁、共济失调、高热、皮肤充血、水肿及脏器出血等现象。非洲猪瘟致死率高，传播速度快，感染的猪发病急，病情重，医治困难，且无安全有效的疫苗预防，一旦发现，只能通过扑杀阻断疫情的蔓延。在我国，将其列为一类传染疾病，是猪病研究中的重点对象。非洲猪瘟是一个结构复杂的二十四面体，其结构蛋白至少50种，而研究最多的结构蛋白是p72、p30和p54。p72蛋白是asfv的衣壳蛋白，参与病毒感染的过程，在病毒感染晚期表达，蛋白序列高度保守，具有良好的免疫原性。p30和p54蛋白是asfv的囊膜蛋白，也是重要的表面抗原。它们在病毒感染细胞的过程中具有相似的功能，参与病毒的吸附与入侵过程，均在病毒感染早期表达，同样具有免疫原性，是理想的疫苗研究抗原。目前非洲猪瘟疫苗效果较好的是减毒活疫苗，可以提供免疫保护，但其存在毒力返强的风险。灭活疫苗，已被证实是无效疫苗。亚单位疫苗、dna载体和病毒载体疫苗，安全性高，可以引起机体的特异性免疫，是否具有免疫保护作用，还需进一步证实。因此，研发出一种安全有效的非洲猪瘟疫苗是继续解决的技术问题。

2、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)属于革兰氏阳性菌，是芽孢杆菌属的一种，由于它可以产生液化淀粉酶分解淀粉，而被命名为解淀粉芽孢杆菌。芽孢杆菌在营养匮乏的情况下，会形成孢子，其孢子可以抵抗热、辐射、有毒化学物质、裂解酶等能够破坏营养细胞的因素。芽孢杆菌的孢子外壳至少含有70多种蛋白，其中cotb、cotc、cotg、cotx、cote、cotg、coty、cotz、cgea、oxdd已被用作分子载体表面展示外源蛋白。芽孢杆菌的孢子可以抵御胃肠道不良环境，在肠道中萌发、生长及产孢。根据这一特性，目前，人们已经在解淀粉芽孢杆菌孢子上成功展示甲型流感病毒、口蹄疫病毒、华支睾吸虫和猪传染性胃肠炎病毒等，接种动物可刺激机体产生粘膜免疫及特异性抗体。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在问题，本发明提供两种孢子蛋白稳定融合表达非洲猪瘟关键抗原的重组解淀粉芽孢杆菌，目前解淀粉芽孢杆菌是一种难转化的菌，未见有关其孢子蛋白作为载体蛋白表达异源蛋白的报道，本发明将非洲猪瘟关键抗原成功展示在解淀粉芽孢杆菌cplk1314孢子蛋白上，表达的蛋白无需纯化，将重组菌的孢子口服免疫小鼠，具有较高的安全性和免疫原性。

2、本发明还提供所述的两种孢子蛋白稳定融合表达非洲猪瘟关键抗原的重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述两种孢子蛋白稳定融合表达非洲猪瘟关键抗原的重组解淀粉芽孢杆菌，所述重组解淀粉芽孢杆菌通过优化后的非洲猪瘟p72蛋白核酸序列，或者优化后的非洲猪瘟p30和p54蛋白核酸序列整合到解淀粉芽孢杆菌孢子表面获得；所述优化后的非洲猪瘟p72蛋白核酸序列、优化后的非洲猪瘟p30蛋白核酸序列以及优化后的非洲猪瘟p54蛋白核酸序列分别如序列seq id no.1所示。

4、其中，所述解淀粉芽孢杆菌为cplk1314。

5、其中，所述解淀粉芽孢杆重组菌中包括编辑载体ptn-cas9以及表达载体ptk-p72-cotb，所述表达载体ptk-p72-cotb其序列如seq id no.4所示。

6、其中，所述或者包括编辑载体ptn-cas9以及表达载体ptk-p3054-cotg，所述表达载体ptk-p3054-cotg其序列如seq id no.5所示。

7、其中，所述表达载体ptk-p72-cotb是以ptk-gfp-cotb为基础载体，将非洲猪瘟p72蛋白的核酸序列与荧光蛋白gfp的核酸序列进行替换。

8、其中，所述表达载体ptk-p3054-cotg以ptk为基础载体，插入p43-sgrna1表达框、非洲猪瘟p30和p54蛋白的核酸序列、以及孢子表面蛋白bacotg基因的核酸序列；所述p43-sgrna1表达框包括p43启动子和sgrna1序列，p43-sgrna1表达框其序列如seq id no.6所示；所述非洲猪瘟p30和p54蛋白的核酸序列，通过柔性linker连接为重组蛋白p3054的核酸序列，所述重组蛋白p3054核酸优化序列如seq id no.7所示；所述孢子表面蛋白bacotg的核酸序列其序列如seq id no.8所示。

9、本发明所述的三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

10、(1)设计并合成优化的p72蛋白核酸序列，将优化合成的p72蛋白核酸序列与ptk-gfp-cotb质粒中的gfp蛋白核酸序列进行替换，获得所述表达载体ptk-p72-cotb；

11、(2)设计并合成优化的p30和p54蛋白的核酸序列，通过柔性linker连接，得到重组蛋白p3054的核酸序列；将重组蛋白p3054的核酸序列与孢子表面蛋白bacotg的核酸序列进行融合，此为解淀粉芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgrna1表达框和同源重组片段依次通过酶切和酶连接克隆至ptk多克隆位点，获得所述基因编辑载体ptk-p3054-cotg；

12、(3)将ptn-cas9与ptk-p72-cotb共同转入解淀粉芽孢杆菌cplk1314，构建重组菌δba72；或者将ptn-cas9与ptk-p3054-cotg共同转入解淀粉芽孢杆菌cplk1314，构建重组菌δba3054。

13、本发明所述的三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组解淀粉芽孢杆菌在制备益生菌制剂中的应用。

14、本发明所述的三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组解淀粉芽孢杆菌在制备诱导产生针对非洲猪瘟抗原的特异性抗体疫苗制剂中的应用。

15、其中，所述疫苗制剂包括口服疫苗或者注射疫苗。

16、进一步地，所述抗原为猪瘟病毒的关键抗原p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白。

17、本发明采用解淀粉芽孢杆菌孢子作为新型纳米颗粒材料，孢子表面蛋白作为新型载体蛋白，融合表达关键抗原。相较于常规的不稳定的胞外、胞内表达体系来说，该孢子表面表达体系具有结构稳定；活性高；耐酸、耐碱、耐高温防止蛋白酶降解等优点。本发明将外源蛋白在解淀粉芽孢杆菌孢子表面表达，该重组菌可以作为疫苗引起小鼠产生针对非洲猪瘟抗原的特异性抗体，为非洲猪瘟口服疫苗的研究提供了新思路。

18、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

19、1、本发明使用双质粒系统，将优化后的非洲猪瘟p72蛋白，或者优化后的非洲猪瘟p30和p54蛋白在解淀粉芽孢杆菌中表达，且有效提高了转化效率；本发明将非洲猪瘟抗原在解淀粉芽孢菌中表达，诱导产生针对非洲猪瘟抗原的特异性抗体，为口服疫苗的制备研究提供思路。

20、2、本发明设计特定的双质粒基因编辑系统，该系统采用crispr-cas9和同源重组技术，极大的提高了重组效率，使难以改造的解淀粉芽孢杆菌作为载体。本发明构建的重组菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，其为益生菌，其次级代谢产物具有抗菌抗病毒作用，可以提高机体免疫力，其表达的异源蛋白无需纯化，可以将重组菌免疫给小鼠。本发明以解淀粉芽孢杆菌孢子作为疫苗载体具有以下优点：(1)芽孢杆菌可以促进淋巴细胞增殖，相关细胞因子分泌，提高机体免疫力；(2)芽孢杆菌可作为粘膜佐剂，经口服、舌下活喷鼻免疫接种，可促进体液和细胞免疫；(3)芽孢杆菌孢子可在肠道萌发，段时间定殖，孢子表面的异源蛋白可持续表达；(4)芽孢杆菌孢子具有稳定性，不仅可以大量生产，还便于储藏和运输。