一种通过大肠杆菌高密度发酵提高腺病毒包装质粒产量的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一种通过大肠杆菌高密度发酵提高腺病毒包装质粒产量的方法。

背景技术：

1、腺病毒(adenovirus，ad)是一种球形、无包膜病毒，直径约70～90nm，衣壳呈20面体立体对称结构，由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(hexon)，另外12个为五邻体(penton)，位于衣壳表面的纤维状刺突是以五邻体蛋白为基底，由衣壳表面伸出的12根纤毛(fiber)，纤毛顶端形成头节区(knob)，五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。腺病毒包装就是将目的片段克隆到腺病毒表达载体上，表达载体和包装质粒通过重组导入腺病毒包装细胞进行包装。腺病毒包装系统按照重组方式主要分为两种，一种在细菌(bj5183)中重组，为adeasytm腺病毒重组系统，另外一种在qbi-293a细胞中重组，为admax腺病毒重组系统，该系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因表达水平高。

2、现有的文献资料中，鲜有对腺病毒包装质粒高密度发酵的工艺介绍。腺病毒包装质粒是腺病毒疫苗制备中的重要一环，需将腺病毒包装质粒和目的基因质粒一并转入293细胞中组装腺病毒。在发酵过程中，质粒的稳定性对于质粒最终产量影响十分巨大。导致质粒稳定性差的主要原因：

3、1、传代次数过多，质粒在细菌分裂中逐渐丢失。

4、2、已丢失质粒的细菌生长速率与含有质粒的细菌生长速率不同，导致无质粒细菌占有优势。

5、大肠杆菌的生长速率主要受培养温度、ph、补料速度、培养基组成等影响。腺病毒包装质粒含有较多的相同重复序列，现有发酵工艺未针对腺病毒包装质粒pdc316-mcmv用质粒进行多参数的工艺开发，导致质粒的表达量不高，细菌生长不稳定，质粒易丢失。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种提高腺病毒包装质粒的发酵产量的方法，用于解决现有技术中目前腺病毒包装质粒发酵中的表达量不高，细菌生长不稳定的问题。本发明通过接种时提高接种量来减少发酵时分裂次数，减少质粒丢失的风险；发酵前期和中后期分别通过降低发酵温度和控制补料速度，来控制细菌的生长速率进一步降低质粒丢失的风险；再综合优化发酵的ph和中后期发酵温度等工艺参数，使细菌生长更稳定，质粒含量得到大幅提升。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种通过大肠杆菌高密度发酵提高腺病毒包装质粒产量的方法，所述方法包括如下步骤：

3、s1、使用基础培养基对质粒生产菌株进行第一阶段培养；

4、s2、载入补料培养基，进行第二阶段培养，培养结束后收获腺病毒包装质粒；

5、所述基础培养基的成分包括：5～15g/l酵母浸粉、5～20g/l甘油、2～5g/l硫酸铵、4～10g/l磷酸氢二钾、2～6g/l磷酸二氢钠、1～3g/l硫酸镁、10ml/l～50ml/l微量元素和体积分数为0.01％-0.02％的消泡剂；

6、所述补料培养基包括100～200g/l酵母浸粉、500～800g/l甘油、2～5g/l硫酸镁、50～200g/l硫酸铵、10～50ml/l微量元素溶液。

7、上述的方法，进一步的，所述质粒生产菌株为大肠杆菌；

8、上述的方法，进一步的，所述腺病毒包装质粒为pdc316-mcmv质粒。

9、上述的方法，进一步的，所述微量元素溶液包括：4～8g/l七水合硫酸亚铁、1～3g/l二水合氯化钙、1～3g/l四水合氯化锰、1～3g/l七水合硫酸锌、0.1～1g/l六水合氯化钴、1～4g/l五水硫酸铜、0.1～1g/l二水合钼酸钠、0.1～1g/l硼酸和0.3～0.6mol/l硫酸。

10、上述的方法，进一步的，所述s1中第一阶段培养发酵温度为30～40℃，ph为6～8，培养时间为10～12小时。

11、上述的方法，进一步的，所述s1中初始od600为1.5～3.0。

12、上述的方法，进一步的，所述s2中所述第二阶段培养时间为：30～32小时。

13、上述的方法，进一步的，所述s2中，载入所述补料培养基的流速为3～9ml·h-1l-1。

14、上述的方法，进一步的，所述s2中，载入所述补料培养基的体积为3000～6000ml。

15、与现有技术相比，本发明的优点在于：

16、本发明提供了一种通过大肠杆菌高密度发酵提高腺病毒包装质粒产量的方法，针对腺病毒包装质粒pdc316-mcmv质粒菌种的发酵工艺进行培养基种类、接种量、ph、温度实验，最终得到一套pdc316-mcmv质粒菌种成熟的发酵工艺，质粒表达量可达800ng/μl以上，是未优化的工艺的四倍，提高了生产的产能，而且本发明所使用的物料廉价易得，发酵工艺简便易行，有利于进行的大规模生产，显著降低了生产的成本。

技术特征：

1.一种通过大肠杆菌高密度发酵提高腺病毒包装质粒产量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒生产菌株为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺病毒包装质粒为pdc316-mcmv质粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量元素溶液包括：4g/l～8g/l七水合硫酸亚铁、1g/l～3g/l二水合氯化钙、1g/l～3g/l四水合氯化锰、1g/l～3g/l七水合硫酸锌、0.1g/l～1g/l六水合氯化钴、1g/l～4g/l五水硫酸铜、0.1g/l～1g/l二水合钼酸钠、0.1g/l～1g/l硼酸和0.3mmol/l～0.6mmol/l硫酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1中所述第一阶段培养中：通过调节转速为50rpm～700rpm，使罐体中相对溶氧量大于等于20％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1中第一阶段培养发酵温度为30℃～40℃，ph为6～8，培养时间为10小时～12小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1中初始od600为1.5～3.0。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2中所述第二阶段培养时间为：30小时～32小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2中，载入所述补料培养基的流速为3ml·h-1l-1～9ml·h-1l-1。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2中，载入所述补料培养基的体积为3000ml～6000ml。

技术总结
本发明提供了一种通过大肠杆菌高密度发酵提高腺病毒包装质粒产量的方法，步骤为：使用基础培养基对质粒生产菌株进行第一阶段培养；载入补料培养基，进行第二阶段培养，培养结束后收获腺病毒包装质粒。本发明通过接种时提高接种量来减少发酵时分裂次数，减少质粒丢失的风险；发酵前期和中后期分别通过降低发酵温度和控制补料速度，来控制细菌的生长速率进一步降低质粒丢失的风险；再综合优化发酵的pH和中后期发酵温度等工艺参数，使细菌生长更稳定，质粒含量得到大幅提升。

技术研发人员：钟晓,颜旭,陈晨,黎陈,张建军,杨波
受保护的技术使用者：楚天科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27