本技术涉及一种预测在基因编辑过程中可能的脱靶的方法。基因编辑过程可以是基因组dna编辑过程，例如使用crispr/cas基因编辑系统。
背景技术：
1、自2005年以来，已提交了各种基因编辑器(例如基于锌指核酸酶、基于talen和基于crispr核酸酶的基因编辑器)的研究中的新药(ind)申请(参见文献[mullard，asher.“基因编辑路线脱靶(gene-editing pipeline takes off)”nature reviews drug discovery19.6(2020):367-373])。与通常具有可逆副作用的其他药物(例如化学药品或抗体)不同，基因组编辑药物的效果是永久性的。也就是说，识别整个基因组中的脱靶位点对于基因组编辑药物尤为重要，因为在基因组编辑过程中经常发生在不良位置的效应(即脱靶效应)会引起重要的安全性问题。为了确认有关基因组编辑过程中可能发生的脱靶效应的信息，许多研究人员已经开发了各种通过各种方法预测整个基因组中的脱靶效应的方法。
2、然而，目前开发的脱靶预测工具(系统)有局限性。例如，基于细胞的方法存在一些问题，例如有时会错过真正的脱靶位点。另一方面，体外和计算机模拟方法存在一些问题，例如显示太多假阳性数据点。
技术实现思路
1、技术问题
2、在使用基因编辑工具(例如，crispr/cas基因编辑系统)进行基因组编辑过程中可能会出现脱靶问题。这种脱靶效应会引起强烈的副作用。本技术的一实施方式提供了一种预测基因组编辑过程中发生的脱靶的方法。
3、技术方案
4、本技术提供了一种预测使用基因编辑系统进行基因编辑过程中发生的脱靶的方法。
5、本技术的一实施方式提供了一种识别在使用crispr/cas基因组编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶信息的方法，该方法包括：
6、(i)制备包含cas蛋白、引导rna和细胞的起始组合物；
7、(ii)通过物理破碎细胞获得待分析组合物，其中，通过物理破碎细胞，基因组dna与由cas蛋白和引导rna形成的cas/grna复合物接触，从而使基因组dna在一个或多个切割位点处被切割；以及
8、(iii)通过分析待分析组合物获得关于切割位点的信息。
9、在具体实施方式中，物理破碎细胞可以包括使细胞通过具有孔的过滤器，其中过滤器中孔的平均直径小于细胞的尺寸。
10、在具体实施方式中，使细胞通过过滤器的力可以是压力。
11、在具体实施方式中，过滤器中孔的平均直径可以是5至15μm。
12、在具体实施方式中，可使用包括具有孔的过滤器的挤出机实现物理破碎第一细胞。
13、在具体实施方式中，挤出机中包括的过滤器中的孔的平均直径可以小于细胞的尺寸。
14、在具体实施方式中，过滤器中的孔的平均直径可以是5至15μm。
15、在具体实施方式中，关于切割位点的信息可以包括以下中的一项或多项：
16、一个或多个切割位点中的每一个在基因组dna上的位置；
17、一个或多个切割位点中的每一个的切割分数；以及
18、切割位点的数量。
19、在具体实施方式中，该方法还可以包括：
20、(iv)从(iii)获得的关于切割位点的信息中识别关于脱靶候选物的信息。
21、在具体实施方式中，脱靶候选物的信息可以包括以下中的一项或多项：
22、一个或多个脱靶候选物中的每一个在基因组dna上的位置；
23、一个或多个脱靶候选物中的每一个的脱靶预测分数；以及
24、预测的脱靶候选物的数量。
25、在具体实施方式中，分析待分析组合物可以包括：通过测序分析待分析组合物中包含的切割的基因组dna。
26、在具体实施方式中，分析待分析组合物可以包括：通过基于pcr的方法分析待分析组合物中包含的切割的基因组dna。
27、在具体实施方式中，可以通过物理破碎细胞来破碎包括细胞膜的细胞的膜结构，从而产生cas/grna复合物可以与来自细胞的基因组dna接触的环境。
28、在具体实施方式中，可以通过物理破碎细胞来破碎包括核膜的细胞的膜结构，从而产生cas/grna复合物可以与来自细胞的基因组dna接触的环境。
29、在具体实施方式中，该方法还可以包括：
30、识别预定的crispr/cas基因组编辑系统，其中预定的crispr/cas基因组编辑系统的识别在(i)之前进行。
31、在具体实施方式中，此处，预定的crispr/cas基因组编辑系统包括使用具有预定的引导序列的预定的引导rna，其中预定的引导序列可以与引导rna的引导序列相同。
32、在具体实施方式中，此处，预定的crispr/cas基因组编辑系统包括使用预定的细胞，其中预定的细胞可以与细胞相同。
33、在具体实施方式中，待分析组合物可以包括裂解的基因组dna，其中来源于物理破碎细胞的基因组dna被cas/grna复合物切割。
34、在具体实施方式中，起始组合物中包含的cas蛋白的浓度可以为4000nm或更多且6000nm或更少。
35、在具体实施方式中，起始组合物中包含的引导rna的浓度可以为4000nm或更多且6000nm或更少。
36、在具体实施方式中，起始组合物中包含的cas/grna复合物的浓度可以为4000nm或更多且6000nm或更少。
37、在具体实施方式中，起始组合物中包含的细胞的浓度可以为1×107个细胞/ml。
38、在具体实施方式中，待分析组合物的获得还可以包括：
39、孵育通过破碎细胞获得的组合物。
40、在具体实施方式中，待分析组合物的获得还可以包括：
41、从通过破碎细胞获得的组合物中去除rna。
42、在具体实施方式中，待分析组合物的获得还可以包括：
43、从通过破碎细胞获得的组合物中纯化dna。
44、本技术的一实施方式提供了一种识别在使用crispr/cas基因组编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶信息的方法，其包括：
45、(i)将包含cas蛋白、引导rna和细胞的起始组合物负载到挤出机的第一容器中；
46、(ii)使用挤出机执行包括以下步骤的挤出过程，以获得待分析组合物：
47、(a)向第一容器施加压力，以将起始组合物的组分从挤出机的第一容器移动到挤出机的第二容器，
48、其中，起始组合物的组分通过施加的压力而通过位于挤出机的第一容器和第二容器之间的具有孔的过滤器，因此混合物沉降在第二容器中，并且
49、其中，通过施加的压力，细胞(其尺寸大于过滤器孔径的组分)被破碎并通过过滤器的孔，
50、其中，通过物理破碎细胞来产生基因组dna可以与cas蛋白和引导rna接触的环境，
51、由此基因组dna与cas/grna复合物接触，
52、从而使基因组dna与cas/grna复合物接触，
53、从而使基因组dna在一个或多个切割位点处被切割；和
54、(iii)分析待分析组合物以获得关于切割位点的信息。
55、在具体实施方式中，施加到第一容器的压力是通过在第一容器和过滤器的方向上推动被设计用于向第一容器施加压力的活塞而产生的。
56、本技术的一实施方式提供了一种识别在使用crispr/cas基因组编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶信息的方法，其包括：
57、(i)将包含cas蛋白、引导rna和细胞的起始组合物负载到挤出机的第一容器中；
58、(ii)使用挤出机执行包括以下步骤的挤出过程，以获得待分析组合物：
59、(a)向第一容器施加压力，以将起始组合物的组分从挤出机的第一容器移动到挤出机的第二容器，
60、其中起始组合物的组分通过施加的压力而通过位于挤出机的第一容器和第二容器之间的具有孔的过滤器，因此混合物沉降在第二容器中，
61、(b)向第二容器施加压力，以将第二容器中包含的混合物的组分从第二容器移动到第一容器，
62、其中第二容器中包含的混合物的组分通过施加的压力而通过位于第一容器和第二容器之间的具有孔的过滤器，因此从第二容器移动到第一容器，从而通过第一容器中的压力使从第二容器移动通过过滤器的混合物沉淀，以及
63、(c)重复执行(a)和(b)预定次数，
64、其中，预定次数以0.5增量计数，0.5表示执行(a)或(b)中的单个过程，并且
65、其中，大于过滤器孔径的细胞通过施加的压力而通过过滤器的孔从而被破碎，
66、其中，物理破碎细胞，产生基因组dna可以与cas蛋白和引导rna接触的环境，
67、从而使基因组dna与cas/grna复合物接触，
68、从而使基因组dna在一个或多个切割位点处被切割；和
69、(iii)分析待分析组合物以获得关于切割位点的信息。
70、在具体实施方式中，施加到第一容器的压力是通过在第一容器和过滤器的方向上推动被设计用于向第一容器施加压力的活塞而产生的，而施加到第二容器的压力则是通过在第二容器和过滤器方向上推动被设计用于向第二容器施加压力的活塞而产生的。
71、有益效果
72、本技术提供了一种预测在基因(例如，基因组)编辑过程中可能发生的脱靶的方法。本技术提供了一种识别在基因组编辑过程中可能发生的脱靶候选物的方法。本技术提供了一种预测脱靶的方法，其可以更简单地执行。本技术的预测脱靶的方法具有基于体外的脱靶预测方法的优点和基于细胞的脱靶预测方法的优点。本技术的脱靶预测方法显示出较小的假阳性率。本技术的脱靶预测方法显示出较小的漏检率。也就是说，当使用本技术的脱靶预测方法时，可以容易且准确地预测基因组编辑过程中可能发生的脱靶。