基于SOD2的辣椒炭疽病LAMP检测引物、快速检测方法

本发明涉及辣椒炭疽病菌检测方法，尤其涉及快速检测辣椒炭疽病菌的lamp引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、辣椒炭疽病是辣椒的主要病害，可导致辣椒减产。辣椒炭疽病不仅危害生长期的辣椒果实和茎叶，还能在采后贮运过程中持续腐坏果实，导致辣椒的产量和品质严重下降。引起辣椒炭疽病的病原菌属于类别复杂、种类繁多的半知菌亚门炭疽菌属colletotrichum。田间辣椒炭疽病的快速检测对合理、高效施用化学药剂具有重要指导作用。

2、目前，辣椒炭疽病菌（ colletotrichum scovillei）的检测主要是通过分离培养病原菌，然后进行形态学特征鉴定和致病性测定结果，该方法对专业技术要求比较高，且存在一定的不确定性，程序繁琐、周期长。虽然基因测序的分析方法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但基层实验室大多不具备基因测序的条件，通常需要把dna样品或pcr扩增片段提交给专门的测序公司进行检测，且获得测序结果以后，还需要对序列进行比对或生物信息学分析，检测过程所需时间较长，检测成本较高，无法满足快速检测的需求，更不适宜基层检验检疫部门在田间应用。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, lamp)是一种新的核酸扩增技术，具有操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，更适合于基层检验检疫部门开展工作，具有极为广泛的应用前景。

4、靶标基因的选择是lamp检测的重要因素之一。目前，分子检测最常用的靶基因有核糖体基因转录间隔区(internal transcribed space, its)，但单一的靶标基因无法进一步提升检测的灵敏度。本项目根据前期的文献和blast序列比对分析，选择了超氧化物歧化酶2 (superoxide dismutase 2, sod2) 基因作为分子鉴定的靶标基因。本发明的实施不仅丰富了lamp检测的靶标基因，且实验表明sod2基因在lamp中的检测灵敏度较its基因更具优势。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种辣椒炭疽病的lamp检测靶标sod2及其检测引物、快速检测方法，该方法检测速度快、操作简单、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。本发明基于环介导等温扩增 (lamp) 技术原理，选取辣椒炭疽病菌超氧化物歧化酶2基因序列为检测靶标，在超氧化物歧化酶2基因序列的6个区域设计了上述6条特异性引物sod2-f3、sod2-b3、sod2-fip、sod2-bip、sod2-lf和sod2-lb，并且通过对反应体系和反应条件的优化，建立以hnb为显色指示剂的辣椒炭疽病菌可视化lamp检测技术。上述三对引物的特异性高，只要6个区域中任一区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。并且，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强，且无需贵重仪器设备，适用于田间辣椒炭疽病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对辣椒炭疽病及时有效的防治具有重要的意义，同时为检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。相对于现有lamp扩增普遍采用2对引物(f3、b3、fip和bip)进行环介导等温扩增，本技术增设的一对环引物lf和lb，不仅可以有效提高扩增效率，还能缩短反应时间。

2、首要目的在于提供快速检测辣椒炭疽病菌的lamp引物，该引物由一对外引物sod2-f3和sod2-b3、一对内引物sod2-fip和sod2-bip以及一对环引物sod2-lf和sod2-lb组成。其中，外引物sod2-f3如seq id no .1所示，外引物sod2-b3如seq id no .2所示，内引物sod2-fip如seq id no .3所示，内引物sod2-bip如seq id no .4所示，环引物sod2-lf如seq id no .5所示，环引物sod2-lb如seq id no .6所示。

3、本发明的另一目的在于提供一种辣椒炭疽病菌的lamp检测试剂盒，其包括如上所述的lamp引物。使用时，操作人员自行提供检测所需要的lamp反应体系的其他试剂即可。

4、进一步的，为了提高lamp检测试剂盒的完整性，减少操作人员的准备工作，所述试剂盒还包括：预混反应缓冲液、反应酶液、引物缓冲液、羟基萘酚蓝染液。可根据体系大小，选用适量的各种溶液配制反应体系，用于对样品进行辣椒炭疽病菌的检测。

5、进一步地，上述试剂盒还可包括：甜菜碱。为了进一步增强扩增反应效果，在试剂盒中增加甜菜碱。甜菜碱 (betaine) 作为高性能的pcr增强剂，可帮助dna聚合酶顺利通过dna某些复杂二级结构，防止dna聚合酶的从模板dna中解离、可稳定dna-蛋白复合物，从而提高lamp扩增的成功率。

6、本发明的另一目的在于提供一种快速检测辣椒炭疽病菌的lamp检测方法，其采用上所述的lamp引物进行lamp扩增。

7、优选地，上述快速检测辣椒炭疽病菌的lamp检测方法包括以下步骤：

8、(1)利用待检测样品dna模板，lamp引物，建立lamp反应体系，进行lamp扩增；

9、25 μl的lamp反应体系包括以下成分

10、10 μm的sod2-f3：0.5 μl

11、10 μm的sod2-b3：0.5 μl

12、10 μm的sod2-fip：4 μl

13、10 μm的sod2-bip：4 μl

14、10 μm的sod2-lf：2 μl

15、10 μm的sod2-lb：2 μl

16、10 × isothermalamp buffer：2.5 μl

17、100 mm的mgso4：1.5 μl

18、25 mm的dntps：1.4 μl

19、0.5 m的betaine (甜菜碱)：1 μl

20、2 mm的hnb (羟基萘酚蓝)：2 μl

21、8 u/μl的bst ii pro dna polymerase large fragment：1 μl

22、dna模板：1 μl。

23、观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或观察琼脂糖凝胶电泳图具有梯形条带判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或琼脂糖凝胶电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

24、上述体系的最佳反应条件为：先在62 ℃反应60 min。上述dna模板的浓度为10fg/μl～100 ng/μl。

25、显色原理为：羟基萘酚蓝是mg2+的滴定剂，在含有mg2+的体系中，呈紫色，随着扩增反应的进行，mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去镁离子呈现天蓝色，而未发生反应的体系则仍保持着紫色，由此可以判断lamp反应结果。

26、优选地，lamp扩增的反应条件为：首先，62℃，60min。

27、可选地，待检测样品dna为提取的含有待检测病原菌基因组的dna。

28、可选地，所述待检测样品dna的提取方法为：

29、取待测样品置于研钵中，加入800 μl 研磨液进行研磨；65 ℃水浴45 min；13 000r/min离心3 min；取750 μl上清于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），上下颠倒5 min；12 000 r/min离心8 min；取上清300 μl，加 2 倍体积的冰乙醇，混匀；12000 r/min离心15 min，弃上清；室温晾干后，加20 μl 灭菌ddh2o溶解。

30、研磨液中包含tris-hcl、nacl、edta、ctab和pvp。更优选的，各组分浓度为tris-hcl：100 mm，nacl：1m，edta：50mm，ctab的质量百分比浓度为2%，pvp的质量百分比浓度为2%。

31、本发明还提供上述lamp引物、试剂盒在检测辣椒炭疽病菌中的应用。

32、本发明实施例提供的快速检测辣椒炭疽病菌的lamp引物及其检测方法和试剂盒具有以下有益效果：

33、1、特异性强：本发明所设的lamp引物是基于辣椒炭疽病菌( colletotrichum  scovillei)的超氧化物歧化酶2 基因序列的特异性区域序列中6个不同区域设计出3对特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。

34、2、灵敏度高：本发明对辣椒炭疽病菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10 fg/μl，具有很高的灵敏性，且灵敏度高于已报道的its引物。

35、3、实用性好：相较于传统的菌株分离培养方法的病原菌检测的周期长，经验依赖性高，准确度低，存在一定的不确定性，以及普通pcr反应对病原菌dna进行扩增、回收和测序，检测时间长，成本高，不能满足经济高效检测的要求，本发明提供的lamp反应检测方法只需要在恒温(62℃)条件下进行短时间反应，结果可通过肉眼在常光下直接判断，能快速准确地检测出病原菌，从而增加了其在农业生产上的应用价值。

36、4、本发明提供的检测方法操作简单、灵敏度和特异性高，且无需贵重仪器设备，适用于田间辣椒炭疽病的早期诊断，对辣椒炭疽病及时有效的防治具有重要意义，同时为检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。