由多能干细胞制造中胚层谱系原条细胞的方法

本发明涉及由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞的方法。本发明还涉及由多能干细胞分化诱导肾祖细胞的方法。

背景技术：

1、目前，推测日本的慢性肾病(ckd)患者数约为1,300万人，被称为新的国民病。针对慢性肾病的根治性治疗方法少，根据其进展情况，必须进行透析治疗的终末期慢性肾功能衰竭患者为30万人以上，这不仅是医学上的一大问题，也是医疗经济上的一大问题。作为包括终末期慢性肾功能衰竭的慢性肾病的根治方法，可列举肾移植，但由于严重的供体器官不足而处于供应完全跟不上需求的状态。

2、肾脏来源于作为早期胚胎组织的间介中胚层，在脊椎动物中，由间介中胚层形成前肾、中肾、后肾3个肾脏，在哺乳类中，后肾形成成体的肾脏。后肾是将分化出被称为间充质的成体肾的肾单位和间质的组织与将由被称为输尿管芽的成体肾集合管分化出下部的肾盂、尿管、膀胱的一部分的组织这两种组织的相互作用而产生的。进一步显示，后肾间质中存在具有分化出构成肾单位的肾小球和数种肾小管上皮细胞的多能性的肾单位祖细胞(非专利文献1、2)。

3、如果确立了由人的人工多能干(ips)细胞、人的胚性干(es)细胞高效分化诱导肾单位祖细胞的方法，则可以期待将来通过三维肾脏的再建来解决肾移植供体不足的问题，作为肾小球、肾小管细胞的供应源用于细胞疗法。进一步，还可以期待发展使用肾小球、肾小管细胞、包含它们的肾组织的药物肾毒性评价体系、使用由疾病特异性ips细胞制作的肾细胞和肾组织的疾病模型的制作、治疗药物的开发等研究。

4、已经报道了几种由人ips细胞、人es细胞分化诱导肾单位祖细胞的方法(非专利文献3～6)，但存在因为使用胚样体(embryoid body，eb)而分化诱导效率低(非专利文献3)、无法确定是否正确再现了发生的各阶段的问题(非专利文献4～6)。

5、此外，本发明人等的团队公开了一种由间介中胚层细胞制造肾祖细胞的方法，包括将间介中胚层细胞用含有tgfβ信号刺激剂和bmp抑制剂的培养基培养的工序(专利文献1)，但需要能够更高效地分化诱导肾祖细胞的方法。

6、现有技术文献

7、专利文献

8、专利文献1：wo2014/200115

9、非专利文献

10、非专利文献1：osafune k.等,development 2006；133:151-61。

11、非专利文献2：kobayashi a.等,cell stem cell 2008；3:169-81。

12、非专利文献3：taguchi a.等,cell stem cell.2014；14:53-67。

13、非专利文献4：takasato m.等,nat cell biol.2014；16:118-26。

14、非专利文献5：takasato m.等,nature.2015；526:564-568。

15、非专利文献6：morizane r.等,nat.biotechnol.2015；33:1193-1200。

技术实现思路

1、发明所要解决的课题

2、本发明的课题在于，提供一种高效地由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞的方法。更具体地，提供一种包括将由多能干细胞诱导的间介中胚层细胞进一步向肾祖细胞分化诱导的工序的、由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞的方法。

3、用于解决课题的方法

4、为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过用含有gsk-3β抑制剂和fgf9的培养基进行黏附培养，能够由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞。本发明是基于这样的见解完成的。

5、即，本发明具有以下特征：

6、[1]一种肾祖细胞的制造方法，包括将间介中胚层细胞用含有gsk(糖原合酶激酶)-3β抑制剂和fgf(成纤维细胞生长因子)9的培养基黏附培养、由间介中胚层细胞诱导肾祖细胞的工序。

7、[2]根据[1]所述的方法，前述肾祖细胞为six2阳性细胞。

8、[3]根据[1]或[2]所述的方法，前述间介中胚层细胞为osr1阳性细胞。

9、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，gsk-3β抑制剂为chir99021。

10、[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，前述培养基进一步含有rock抑制剂。

11、[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，前述黏附培养使用由细胞外基质包被的培养容器来进行。

12、[7]根据[6]所述的方法，前述细胞外基质为层粘连蛋白511的e8片段。

13、[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，前述间介中胚层细胞为由多能干细胞诱导的间介中胚层细胞。

14、[9]根据[8]所述的方法，前述间介中胚层细胞为通过包括以下的工序(i)～(v)的方法制造的间介中胚层细胞。

15、(i)将多能干细胞用含有fgf2、bmp(骨形态发生蛋白)4、gsk-3β抑制剂和视黄酸或其衍生物的培养基培养的工序；

16、(ii)将工序(i)中得到的细胞用含有fgf2、gsk-3β抑制剂和bmp7的培养基培养的工序；

17、(iii)将工序(ii)中得到的细胞用含有fgf2、gsk-3β抑制剂、bmp7和tgfβ抑制剂的培养基培养的工序；

18、(iv)将工序(iii)中得到的细胞用含有fgf2、gsk-3β抑制剂、bmp7、激活素和rock抑制剂的培养基培养的工序；以及

19、(v)将工序(iv)中得到的细胞用含有视黄酸或其衍生物和fgf9的培养基培养的工序。

20、[10]根据[9]所述的方法，工序(v)的培养基进一步含有bmp抑制剂。

21、[11]根据[8]至[10]中任一项所述的方法，前述多能干细胞为人工多能干(ips)细胞。

22、[12]根据[11]所述的方法，前述ips细胞为人ips细胞。

23、[13]一种由多能干细胞制造肾祖细胞的方法，包括以下的工序(i)～(vi)。

24、(i)将多能干细胞用含有fgf2、bmp4、gsk-3β抑制剂和视黄酸或其衍生物的培养基培养的工序；

25、(ii)将工序(i)中得到的细胞用含有fgf2、gsk-3β抑制剂和bmp7的培养基培养的工序；

26、(iii)将工序(ii)中得到的细胞用含有fgf2、gsk-3β抑制剂、bmp7和tgfβ抑制剂的培养基培养的工序；

27、(iv)将工序(iii)中得到的细胞用含有fgf2、gsk-3β抑制剂、bmp7、激活素和rock(rho-kinase)抑制剂的培养基培养的工序；

28、(v)将工序(iv)中得到的细胞用含有视黄酸或其衍生物和fgf9的培养基培养的工序；以及

29、(vi)将工序(v)中得到的细胞用含有gsk-3β抑制剂和fgf9的培养基培养、由间介中胚层细胞诱导肾祖细胞的工序。

30、[14]根据[13]所述的方法，工序(v)的培养基进一步含有bmp抑制剂。

31、[15]根据[13]或[14]所述的方法，前述肾祖细胞为six2阳性细胞。

32、[16]根据[13]～[15]中任一项所述的方法，前述工序(v)中得到的细胞为osr1阳性细胞。

33、[17]根据[13]～[16]中任一项所述的方法，前述gsk-3β抑制剂为chir99021。

34、[18]根据[13]～[17]中任一项所述的方法，前述工序(vi)的培养基进一步含有rock抑制剂。

35、[19]根据[13]～[18]中任一项所述的方法，前述培养使用由细胞外基质包被的培养容器来进行。

36、[20]根据[19]所述的方法，前述细胞外基质为层粘连蛋白511的e8片段。

37、[21]根据[13]～[20]中任一项所述的方法，前述多能干细胞为人工多能干(ips)细胞。

38、[22]根据[21]所述的方法，前述ips细胞为人ips细胞。

39、[23]一种肾祖细胞，其是通过[1]～[22]中任一项所述的方法制造的。

40、[24]一种肾脏类器官，其是使用通过[1]～[22]中任一项所述的方法制造的肾祖细胞得到的。

41、[25]一种医药组合物，包含通过[1]～[22]中任一项所述的方法制造的肾祖细胞或使用其得到的肾脏类器官。

42、[26]一种肾病治疗剂，包含通过[1]～[22]中任一项所述的方法制造的肾祖细胞或使用其得到的肾脏类器官。

43、发明的效果

44、根据本发明的方法，因为通过黏附培养进行培养，所以能够以80％以上的高效率由人ips细胞分化诱导肾祖细胞。进一步，因为是使派生出后肾间质肾单位祖细胞的后部上胚层、晚期体节中胚层细胞、后部间介中胚层细胞各发生分化阶段正确再现的方法，所以能够进行各阶段细胞的分析。

45、后肾为形成成体肾的一种胎儿肾组织，是肾脏再生中必需的组成部分。此外，发生在后肾肾单位祖细胞、由其派生的肾小球、肾小管中的肾病多，因此本发明的方法在肾病模型制作中也是有用的。因此，本发明的方法在针对肾病的治疗方法、治疗药物的探索的观点上也是有用的。