用于治疗β-血红蛋白病的CRISPR/CAS相关方法和组合物与流程

本发明涉及用于编辑靶核酸序列或调控靶核酸序列表达的crispr/cas相关方法和组分，及其与包括镰状细胞病和β-地中海贫血的β-血红蛋白病的结合应用。

背景技术：

1、血红蛋白(hb)将氧气从肺部携带到红细胞或红血细胞(rbc)中的组织。在胚胎发育期间和出生后不久，血红蛋白以胎儿血红蛋白(hbf)的形式存在，胎儿血红蛋白是由两个α-珠蛋白链和两个γ-珠蛋白链组成的四聚体蛋白质。hbf在很大程度上被成人血红蛋白(hba)替换，成人血红蛋白是一种四聚体蛋白质，其中hbf的γ-珠蛋白链通过称为珠蛋白转换的过程被β-珠蛋白链替换。hbf在携带氧气方面比hba更有效。普通成人的总血红蛋白小于1％的hbf(thein 2009)。α-血红蛋白基因位于16号染色体上，而β-血红蛋白基因(hbb)、γ(γa)-珠蛋白链(hbg1，也称为γ珠蛋白a)和gγ(γg)-珠蛋白链(hbg2，也称为γ珠蛋白g)位于珠蛋白基因簇内的11号染色体上(即，珠蛋白基因座)。

2、hbb的突变可引起血红蛋白障碍(即，血红蛋白病)，包括镰状细胞病(scd)和β-地中海贫血(β-thal)。美国大约93,000人被诊断患有血红蛋白病。全球每年有300,000儿童出生患有血红蛋白病(angastiniotis 1998)。因为这些病症与hbb突变有关，所以他们的症状典型地直到珠蛋白从hbf转换为hba后才表现。

3、scd是美国最常见的遗传性血液病，影响大约80,000人(brousseau 2010)。scd在非洲血统的人中最常见，scd的流行率为500人中有1人。在非洲，scd的流行率为1500万(aliyu，2008)。scd在印度人，沙特阿拉伯人和地中海人后裔中也更常见。在西班牙裔美国人后裔中，镰状细胞病的流行率为1000人中有1人(lewis2014)。

4、scd由hbb基因中的单个纯合突变引起，c.17a>t(hbs突变)。镰状突变是hbb上的点突变(gag→gtg)，其导致缬氨酸取代外显子1中氨基酸位置6的谷氨酸。β-血红蛋白链位置6的缬氨酸是疏水性的，并且当β-珠蛋白不与氧气结合时，引起β-珠蛋白构象的变化。这种构象变化引起hbs蛋白在没有氧的情况下聚合，导致rbc变形(即，镰状)。scd以常染色体隐性方式遗传，因此只有具有两个hbs等位基因的患者才患有所述疾病。杂合的受试者具有镰状细胞性状，如果他们严重脱水或缺氧，可能患有贫血和/或痛性危象。

5、镰状形状的rbc引起多种症状，包括贫血、镰状细胞危象、血管阻塞性危象，再生障碍性危象和急性胸部综合征。镰状形状的rbc比野生型rbc弹性小，因此不能容易地通过毛细血管床并导致阻塞和缺血(即，血管阻塞)。当镰状细胞阻塞器官毛细血管床中的血流导致疼痛、缺血和坏死时，就会发生血管阻塞性危象。这些发作典型地持续5天至7天。脾脏在清除功能失调的rbc中起作用，因此典型地在儿童早期期间扩大并且频繁发生血管阻塞性危象。到儿童期结束时，scd患者的脾经常梗塞，导致自体脾切除。溶血是scd的一个恒定特征并引起贫血。镰状细胞在循环中存活10天至20天，而健康的rbc存活90天至120天。必要时输血scd受试者以维持足够的血红蛋白水平。频繁的输血使受试者有感染hiv、乙型肝炎、和丙型肝炎的风险。受试者还可能患有急性胸部危象和四肢、终末器官、和中枢神经系统的梗塞。

6、患有scd的受试者的生命期望降低。通过对危象和贫血进行认真的，终身的管理，scd患者的预后正在稳定地改进。在2001年，患有镰状细胞病的受试者的平均生命期望是50岁中后期。目前对scd的治疗涉及危象期间的水合和疼痛管理，以及根据需要进行输血以校正贫血。

7、地中海贫血(例如，β-thal、δ-thal、和β/δ-thal)引起慢性贫血。估计β-thal影响全球大约100,000人中有1人。它在某些群体中的流行率较高，包括欧洲后裔的群体，其流行率大约为10,000人中有1人。除非通过终身输血和螯合疗法治疗，否则重型β-thal是疾病的更严重形式，是危及生命的。在美国，大约有3,000名患有重型β-thal的受试者。中间型β-thal不需要输血，但可能引起生长延迟和显著的全身异常，并且频繁地需要终身螯合疗法。尽管hba构成成人rbc中大多数血红蛋白，但大约3％的成人血红蛋白是hba2形式，hba变体是两个γ-珠蛋白链被两个δ(δ)-珠蛋白链替换。δ-thal与引起hbd表达损失的δ血红蛋白基因(hbd)突变有关。hbd突变的共遗传可以通过将hba2水平降低至正常范围来掩盖β-thal(即，β/δ-thal)的诊断(bouva 2006)。β/δ-thal通常由两个等位基因中hbb和hbd序列的缺失引起。在纯合的(δ°/δ°β°/β°)患者中，表达hbg，导致单独产生hbf。

8、与scd一样，β-thal是由hbb基因突变引起的。导致β-thal的最常见的hbb突变是：c.-136c>g、c.92+1g>a、c.92+6t>c、c.93-21g>a、c.118c>t、c.316-106c>g、c.25_26delaa、c.27_28insg、c.92+5g>c、c.118c>t、c.135delc、c.315+1g>a、c.-78a>g、c.52a>t、c.59a>g、c.92+5g>c、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-78a>g、c.52a>t、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-138c>t、c.-79a>g、c.92+5g>c、c.75t>a、c.316-2a>g、和c.316-2a>c。与β-thal有关的这些和其他突变引起β-珠蛋白链的突变或缺失，这导致正常hbα-血红蛋白与β-血红蛋白比率的破坏。过量的α-珠蛋白链在骨髓中的红系前体中沉淀。

9、在重型β-thal中，hbb的两个等位基因都含有无意义突变、移码突变、或剪接突变，导致完全不存在β-珠蛋白产生(表示为β°/β°)。重型β-thal导致β-珠蛋白链的严重减少，导致红系细胞中α-珠蛋白链的显著沉淀和更严重的贫血。

10、中间型β-thal由hbb的5′或3'非翻译区域突变、启动子区域突变、或hbb多聚腺苷酸化信号或hbb基因内的剪接突变导致。患者基因型表示为β°/β+或β+/β+。β°代表不存在β-珠蛋白链的表达；β+代表功能失调但存在的β-珠蛋白链。表型表达因患者而异。由于存在一些β-珠蛋白的产生，中间型β-thal导致红系前体中α-珠蛋白链的沉淀较少，并且与重型β-thal相比导致较少的严重贫血。然而，继发于慢性贫血的红系谱系扩增有更显著的后果。

11、具有重型β-thal的受试者存在于6个月和2岁之间，并且患有未能茁壮成长、发热、肝脾大和腹泻。足够的治疗包括定期输血。重型β-thal疗法还包括脾切除术和羟基脲治疗。如果患者定期输血，他们将正常发育，直到第二个十年开始。那时，他们需要螯合疗法(除了继续输血)以防止铁超过载的并发症。铁过载可能表现为生长延迟或性成熟延迟。在成人期，不充分的螯合疗法可能导致心肌病、心律失常、肝纤维化和/或肝硬化、糖尿病、甲状腺和甲状旁腺异常、血栓症和骨质疏松症。频繁的输血还使受试者有感染hiv、乙型肝炎、和丙型肝炎的风险。

12、中间型β-thal受试者通常存在于2岁至6岁之间。他们通常不需要输血。然而，由于红系谱系的慢性肥大而发生骨异常以补偿慢性贫血。由于骨质疏松症，受试者可能有长骨骨折。髓外红细胞生成是常见的并且导致脾，肝和淋巴结的扩大。它还可能引起脊髓压缩和神经系统问题。受试者还患有下肢溃疡并且血栓形成事件的风险增加，包括中风、肺栓塞和深静脉血栓形成。中间型β-thal的治疗包括脾切除术、叶酸补充、羟基脲疗法和髓外肿块的放射治疗。螯合疗法用于发生铁过载的受试者。

13、β-thal患者的生命期望通常会降低。患有重型β-thal且未接收输血疗法的受试者通常在其第二或第三个十年死亡。接收常规输血和足够螯合疗法的重型β-thal受试者可以活到第五个十年甚至更长时间。继发于铁毒性的心脏衰竭是由于铁毒性导致的重型β-thal受试者死亡的主要原因。

14、目前正在发育scd和β-thal的各种新治疗。目前正在临床试验中研究经由基因疗法递送校正的hbb基因。然而，这种途径的长期功效和安全性尚不清楚。已经证明用来自hla匹配的异基因干细胞供体的造血干细胞移植治疗scd和β-thal，但是所述方法涉及风险，包括与切除疗法有关的风险，以准备移植受试者和移植后移植物抗宿主疾病的风险。另外，通常无法识别匹配的异基因供体。因此，需要改进的管理这些和其他血红蛋白病的方法。

技术实现思路

1、本文在某些实施例中提供了使用基因组编辑系统(例如，crispr/cas介导的基因组编辑系统)增加受试者或细胞中一种或多种γ-珠蛋白基因(例如，hbg1、hbg2、或hbg1和hbg2)的表达(即，转录活性)的方法。在某些实施例中，这些方法可利用任何修复机制来改变(例如，删除、破坏或修饰)一种或多种γ-珠蛋白基因调控元件的全部或部分。在某些实施例中，这些方法可利用dna修复机制，例如，nhej或hdr来删除或破坏一种或多种γ-珠蛋白基因调控元件(例如，沉默子，增强子，启动子或隔离子)。在某些实施例中，这些方法利用dna修复机制，例如，hdr，来改变，包括突变、插入、删除或破坏γ-珠蛋白基因调控元件中的一个或多个核苷酸的序列(例如，沉默子、增强子、启动子、或隔离子)。在某些实施例中，这些方法利用一种或多种dna修复机制的组合，例如，nhej和hdr。在某些实施例中，这些方法导致与天然存在的hpfh变体有关的γ-珠蛋白调控元件的突变或变异，包括，例如，hbg113bp del c.-114至-102、4bp del c.-225至-222、c.-114c>t、c.-117g>a、c.-158c>t、c.-167c>t、c.-170g>a、c.-175t>g、c.-175t>c、c.-195c>g、c.-196c>t、c.-198t>c、c.-201c>t、c.-251t>c、或c.-499t>a、或hbg2 13bp del c.-114至-102、c.-109g>t、c.-114c>a、c.-114c>t、c.-157c>t、c.-158c>t、c.-167c>t、c.-167c>a、c.-175t>c、c.-202c>g、c.-211c>t、c.-228t>c、c.-255c>g、c.-309a>g、c.-369c>g、或c.-567t>g。

2、本文在某些实施例中提供了使用crispr/cas介导的基因组编辑来治疗有需要的受试者中的β-血红蛋白病以增加一种或多种γ-珠蛋白基因(例如，hbg1、hbg2、或hbg1和hbg2)的表达(即，转录活性)的方法。在某些实施例中，这些方法利用dna修复机制，例如，nhej或hdr来删除或破坏一种或多种γ-珠蛋白基因调控元件(例如，沉默子，增强子，启动子或隔离子)。在某些实施例中，这些方法利用dna修复机制，例如，hdr，来改变，包括突变、插入、删除或破坏γ-珠蛋白基因调控元件中的一个或多个核苷酸的序列(例如，沉默子、增强子、启动子、或隔离子)。在某些实施例中，这些方法利用一种或多种dna修复机制的组合，例如，nhej和hdr。在某些实施例中，这些方法导致与天然存在的hpfh变体有关的γ-珠蛋白调控元件的突变或变异，包括，例如hbg1 13bp del c.-114至-102、4bp del c.-225至-222、c.-114c>t、c.-117g>a、c.-158c>t、c.-167c>t、c.-170g>a、c.-175t>g、c.-175t>c、c.-195c>g、c.-196c>t、c.-198t>c、c.-201c>t、c.-251t>c、或c.-499t>a、或hbg2 13bp delc.-114至-102、c.-109g>t、c.-114c>a、c.-114c>t、c.-157c>t、c.-158c>t、c.-167c>t、c.-167c>a、c.-175t>c、c.-202c>g、c.-211c>t、c.-228t>c、c.-255c>g、c.-309a>g、c.-369c>g、或c.-567t>g。在某些实施例中，β-血红蛋白病是scd或β-thal。

3、本文在某些实施例中提供了用于crispr/cas介导的增加一种或多种γ-珠蛋白基因(例如hbg1、hbg2、或hbg1和hbg2)的表达(即，转录活性)的方法的grna。在某些实施例中，这些grna包含靶向结构域，所述结构域包含seq id no:251-901所示的核苷酸序列。在某些实施例中，这些grna进一步包含第一互补结构域、第二互补结构域、连接结构域、5'延伸结构域，近端结构域或尾部结构域中的一个或多个。在另一个实施例中，grna是模块化grna。在其他实施例中，所述grna是单分子(或嵌合的)grna。