反枝苋CYP78A5基因及其应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种反枝苋cyp78a5基因及其应用。

背景技术：

1、反枝苋，苋科苋属一年生c4植物，是我国大豆玉米等秋熟作物田常见杂草，在我国东北大豆田分布广泛。因其适应性强、传播方式多样、生长迅速、4叶期后无特效除草剂及大豆迎茬种植的特点，成为大豆田恶性杂草，严重影响大豆产量与品质。一般可使大豆减产20％，危害严重时，会使大豆减产50％以上。

2、目前，大豆田使用的阔叶杂草除草剂主要是ppo抑制剂类除草剂。氟磺胺草醚因其除草效率高、选择性好、杀草谱宽等优点，成为我国大豆田防除包括反枝苋在内的阔叶杂草的主要除草剂。但是，随着该除草剂的常年大量使用，部分反枝苋种群对其产生了抗性。滕春红等对黑龙江省反枝苋进行氟磺胺草醚敏感性测定，发现部分反枝苋种群对其产生5-100倍抗性；随后反枝苋对氟磺胺草醚的高抗性也多有报道。

3、目前为止已有14种杂草对ppo抑制剂产生了抗性，其中有7种杂草有报道对ppo抑制剂产生抗性的作用机理，主要报道是靶标抗性机理。包括靶标基因ppx2中δgly210、arg128、val361、gly399，ppx1中ala212位突变。目前关于反枝苋对ppo抑制剂作用机理的报道主要是其靶标基因ppx2中arg128位突变。p450基因家族编码的是参与除草剂第一阶段代谢解毒的最通用的一类酶。由p450s介导的各种反应，包括羟基化、环氧化、脱烷基、异构化、脱羧和脱氨，导致氧合产物通常更具活性或更易溶解，从而为后续的解毒反应创造条件。但是，对于反枝苋中是否存在(像稗草中cyp81a24与播娘蒿中cyp77b34等基因)可以代谢ppo抑制剂类除草剂的相关基因尚不清楚。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种反枝苋cyp78a5基因及其应用。该基因是一种全新或功能信息未知的反枝苋代谢ppo抑制剂类除草剂的cyp450基因，可以在植物体内代谢解毒ppo抑制剂类除草剂，尤其是在反枝苋体内代谢解毒氟磺胺草醚；可以用于鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种反枝苋cyp78a5基因，所述反枝苋cyp78a5基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如seqid no.2所示。

3、优选地，所述反枝苋cyp78a5基因的核苷酸序列还包括seq id no.1经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；也包括与seq id no.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

4、所述反枝苋cyp78a5基因可以在植物体内代谢解毒ppo抑制剂类除草剂；

5、优选地，所述反枝苋cyp78a5基因的代谢解毒包括：在反枝苋体内代谢解毒氟磺胺草醚，具体表现为：

6、ⅰ、cyp78a5基因在反枝苋抗性种群r中的表达量显著高于在敏感种群s1中的表达量；

7、ⅱ、cyp78a5基因在反枝苋抗性种群r中的表达量显著高于在三个敏感种群s1、s2、s3中的表达量；

8、优选地，所述cyp78a5基因的代谢解毒还包括：将所述cyp78a5基因基因在拟南芥中过表达，得到的转基因拟南芥对氟磺胺草醚的耐受性高于野生型拟南芥。

9、本发明还提供了一种所述反枝苋cyp78a5基因的应用，所述反枝苋cyp78a5基因用于鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。具体方法为：根据cyp78a5基因的相对表达量来鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。

10、本发明还提供了一种检测反枝苋cyp78a5基因表达量的方法，该方法包括以下步骤：

11、s1、提取待测植物总rna，反转录成cdna；

12、s2、根据目的基因cyp78a5的核苷酸序列seq id no.1设计荧光定量qpcr引物，并以18s rrna(18s)为内参基因；

13、所述目的基因cyp78a5的qpcr引物的核苷酸序列为：

14、cyp78a5-f：seq id no.3，

15、cyp78a5-r：seq id no.4；

16、所述内参基因18s的引物的核苷酸序列为：

17、18s-f：seq id no.5，

18、18s-r：seq id no.6；

19、s3、以s1得到的cdna为模板进行qpcr反应，建立标准曲线，验证目标基因cyp78a5及内参基因18s引物的可靠性；并计算cyp78a5基因在待测植物中的相对表达量；

20、所述qpcr反应体系为20μl：2×perfectstart green qpcr supermix 10μl，10μmol/l上游引物0.4μl，10μmol/l下游引物0.4μl，passive reference dye(50×)0.4μl，无菌水7.8μl，模板cdna 1μl；

21、所述qpcr反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃引物退火34s并进行荧光信号采集，共40个循环。

22、本发明与现有技术相比具有以下优点：

23、1、本发明中首次从反枝苋中克隆了一种cyp450基因cyp78a5，该基因与苋菜、藜麦、菠菜、甜菜中的cyp78a5基因高度同源，且在对氟磺胺草醚具有代谢抗性的反枝苋种群中的表达量显著高于敏感种群。本发明首次揭示了反枝苋cyp78a5基因与ppo抑制剂类除草剂抗性之间的关系，可通过检测反枝苋cyp78a5基因的表达量来鉴定反枝苋对除草剂是否产生代谢抗性，对及时发现抗性并指导农田科学用药及缓解抗药性进一步蔓延具有实际指导意义。

24、2、本发明提供了用于检测反枝苋cyp78a5基因表达量的荧光定量pcr引物以及基于该引物建立的检测反枝苋cyp78a5基因表达量的方法，以此判断反枝苋对ppo抑制剂(特别是氟磺胺草醚)类除草剂的抗性。该方法具有简便、灵敏度高、特异性强的优点，在反枝苋对氟磺胺草醚非靶标抗性的检测和研究中具有重要的应用前景。

25、3、本发明将反枝苋cyp78a5基因在拟南芥中进行过表达并测定转基因拟南芥对氟磺胺草醚的敏感性，结果表明转基因拟南芥对氟磺胺草醚的耐受性明显高于野生型拟南芥，证明了cyp78a5是反枝苋对氟磺胺草醚获得抗性的原因之一。

26、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

技术特征：

1.一种反枝苋cyp78a5基因，其特征在于，所述反枝苋cyp78a5基因的核苷酸序列如seqid no.1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的反枝苋cyp78a5基因，其特征在于，所述反枝苋cyp78a5基因的核苷酸序列还包括seq id no.1经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；也包括与seq id no.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的反枝苋cyp78a5基因，其特征在于，所述反枝苋cyp78a5基因在植物体内代谢解毒ppo抑制剂类除草剂。

4.根据权利要求3所述的反枝苋cyp78a5基因，其特征在于，所述反枝苋cyp78a5基因的代谢解毒包括：在反枝苋体内代谢解毒氟磺胺草醚，具体表现为：

5.根据权利要求3所述的反枝苋cyp78a5基因，其特征在于，所述cyp78a5基因的代谢解毒还包括：将所述cyp78a5基因基因在拟南芥中过表达，得到的转基因拟南芥对氟磺胺草醚的耐受性高于野生型拟南芥。

6.一种如权利要求1-5任一权利要求所述的反枝苋cyp78a5基因的应用，其特征在于，所述反枝苋cyp78a5基因用于鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反枝苋cyp78a5基因用于鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性的方法为：根据cyp78a5基因的相对表达量来鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。

8.一种检测反枝苋cyp78a5基因表达量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

技术总结
本发明提供了一种反枝苋CYP78A5基因及其应用。所述反枝苋CYP78A5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次揭示了反枝苋CYP78A5基因与PPO抑制剂类除草剂抗性之间的关系，可通过检测反枝苋CYP78A5基因的表达量来鉴定反枝苋对除草剂是否产生代谢抗性，对及时发现抗性并指导农田科学用药及缓解抗药性进一步蔓延具有指导意义。本发明还提供了用于检测反枝苋CYP78A5基因表达量的荧光定量PCR引物以及基于该引物建立的检测反枝苋CYP78A5基因表达量的方法；该方法具有简便、灵敏度高、特异性强的优点，在反枝苋对PPO抑制剂类除草剂非靶标抗性的检测和研究中具有重要的应用前景。

技术研发人员：黄兆峰,曹艺,高海峰,崔海兰,李香菊,黄红娟,魏守辉,沈煜洋
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17