一种NKT细胞体外扩增方法与流程

本发明属于细胞培养，尤其涉及一种nkt细胞体外扩增方法。

背景技术：

1、自然杀伤性t细胞(nature killer t cells，nkt cells)发现于1986年，是除nk细胞、t淋巴细胞和b淋巴细胞之外的第四类淋巴细胞，是一类可引起适应性免疫和固有免疫的特殊t细胞亚群。nkt细胞主要分布于肝脏、骨髓、胸腺、脾及外周血中，少量分布于脐带血中。作为t细胞中一个独立的亚群，虽然数量稀少(约占人外周血单核细胞的1％～5％)，但是在多种疾病，包括自身免疫疾病、感染和恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。

2、nkt细胞不同于传统的t细胞，兼具nk细胞和t细胞的功能特点，既能表达nk细胞的表面标志(在人类为cd56、cd161)，又能表达t细胞表面标志，如cd3、αβtcr；nkt细胞生物学功能主要包括免疫调节和细胞毒作用。同时诸多临床结果显示nkt细胞过继回输治疗的重要价值，未来将为临床医学带来新的突破。

3、外周血来源的单个核细胞是nkt细胞过继免疫细胞治疗的主要来源，然而nkt细胞仅占人外周血淋巴细胞总数的1％～5％，因此需要在体外大量扩增培养，来满足临床需求。目前，在nkt细胞常规培养中，大多通过磁珠分选或流式分选后进行扩增培养。但是磁珠分选和流式分选操作流程繁琐，增加了细胞污染的风险，成本较高，得到的nkt细胞数量不足，纯度低，杀伤活性一般，不能达到临床治疗的标准。

4、专利cn108690830b提供了一种扩增nkt细胞的方法，该方法采用抗体包被的方式激活nkt细胞，操作流程复杂，且该方法培养14天后nkt细胞扩增数量少，nkt细胞纯度低。专利cn107475195b也公开了一种nkt细胞的培养方法，该专利是利用无包被的方式对nkt细胞进行激活和扩增。但该专利在激活扩增过程中使用两种培养基，操作流程繁琐，且培养14天后nkt细胞的扩增倍数低、nkt细胞杀伤活性差。因此，开发出一种高数量、高纯度、高杀伤活性的nkt细胞培养方法显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明提供了一种nkt细胞体外扩增方法，本发明提供的扩增方法操作简单，成本低，且nkt细胞的扩增数量高、纯度高，具有较强的杀伤活性，可用于过继免疫治疗。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种nkt细胞体外扩增方法，包括如下步骤：

3、1)第0天，用完全培养基重悬pbmc，在37℃，5％co2静置培养；

4、所述完全培养基是以无血清培养基作为基础培养基，添加500～2000u/ml的ifn-γ和基础培养基体积5％的自体灭活血浆；

5、2)第1天，补加浓度为0.1～1μg/ml的cd28抗体、0.1～1μg/ml的cd3抗体、0.05～5ug/ml的cd16抗体、500～5000u/ml的il-2和10～200ng/ml的il-7，在37℃，5％co2继续培养；

6、3)在37℃，5％co2继续培养至第7天，得到激活nkt细胞；其中，在该步骤的继续培养过程中补加两次含500～5000u/ml的il-2、10～200ng/ml的il-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基；

7、4)第7天，将激活nkt细胞接种在扩增培养基中，并在扩增培养基中添加扩增培养基体积5％的自体灭活血浆，在37℃，5％co2进行培养；

8、所述扩增培养基以无血清培养基作为基础培养基，添加500～5000iu/ml il-2；

9、5)第14天后停止培养，收获nkt细胞。

10、优选的，培养至第7天后，平均每两天补充一次扩增培养基。

11、优选的，步骤1)中用完全培养基重悬pbmc后，接种密度为1.0～2.0×106cell/ml。

12、优选的，所述无血浆培养基为nkt细胞无血清培养基。

13、优选的，步骤3)～4)中补充培养基或接种后，细胞密度在1.0～2.0×106cell/ml。

14、优选的，步骤1)中所述pbmc从外周血中分离得到。

15、优选的，采用如下方式从外周血中分离pbmc：

16、将外周抗凝全血进行离心，离心后，分离管中从下到上依次为红细胞、粒细胞、分离液、分离胶、pbmc和血浆，吸取分离胶上的白膜层，即pbmc。

17、优选的，所述自体灭活血浆采用如下方法得到：采集白膜层上的血浆，在56℃加热血浆30min，将灭活后的血浆4℃放置30min，室温1000g离心10min，取上清，即为自体灭活血浆。

18、优选的，步骤5)中收获nkt细胞后还进行取样检测。

19、优选的，取样检测nkt细胞中真菌、细菌、支原体和内毒素是否异常。

20、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

21、本发明提供的nkt细胞体外扩增方法，整个激活扩增过程中均以无血清培养基作为基础培养基，在此基础上添加适宜的细胞因子，整个培养过程使用同一种培养基，操作简单。且本发明提供的方法无需分选，无需滋养层细胞，无需包被，就能从外周血中扩增出nkt细胞，操作简单，成本低。

22、本发明提供的nkt细胞体外扩增方法，在基础培养基的基础上添加适宜的细胞因子，通过各因子间的协同作用，使得扩增数量高、纯度高，且具有较强的杀伤活性。该方法制备的nkt细胞cd3+cd56+表达率高达90.18％，经过15天培养，nkt细胞可扩增约17000倍，收获45亿nkt细胞，且体外杀瘤活性显著，当效靶比为10：1时nkt细胞杀伤率可到97.1％，满足临床应用的需求。

技术特征：

1.一种nkt细胞体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，培养至第7天后，平均每两天补充一次扩增培养基。

3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤1)中用完全培养基重悬pbmc后，接种密度为1.0～2.0×106cell/ml。

4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述无血浆培养基为nkt细胞无血清培养基。

5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤3)～4)中补充培养基或接种后，细胞密度在1.0～2.0×106cell/ml。

6.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤1)中所述pbmc从外周血中分离得到。

7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，采用如下方式从外周血中分离pbmc：

8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，所述自体灭活血浆采用如下方法得到：采集白膜层上的血浆，在56℃加热血浆30min，将灭活后的血浆4℃放置30min，室温1000g离心10min，取上清，即为自体灭活血浆。

9.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤5)中收获nkt细胞后还进行取样检测。

10.根据权利要求9所述的扩增方法，其特征在于，取样检测nkt细胞中真菌、细菌、支原体和内毒素是否异常。

技术总结
本发明提出一种NKT细胞体外扩增方法，属于细胞培养技术领域。该方法包括激活NKT细胞和扩增NKT细胞两个阶段，整个激活扩增过程中均以无血清培养基作为基础培养基，在此基础上添加适宜的细胞因子来进行激活扩增。本发明提供的扩增方法操作简单，成本低，且NKT细胞的扩增数量高、纯度高，具有较强的杀伤活性。

技术研发人员：王建刚,赵丽娜,王彦娜,韩倩,董文康,来庆英,吴明远
受保护的技术使用者：康立泰生物医药（青岛）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17