一种ctDNA检测试剂盒及检测方法

本发明属于生物检测，涉及一种ctdna检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、近红外电化学发光(nir ecl)已成为一种强大的分析技术，因为它结合了近红外和ecl分析方法的优点，如具有良好的光稳定性，易于控制和零背景信号。尽管人们探索了各种近红外ecl发光团，如半导体量子点(qds)、金属纳米团簇和镧系金属有机骨架，但它们的广泛应用受到重金属、高成本、低效率和生物相容性差等问题的阻碍。因此，开发高效的近红外ecl发光体对于推进生物分析和传感性能仍然至关重要。

2、近来，有机纳米材料，例如有机聚合物和小分子纳米粒子，表现出独特的光学特性，卓越的生物相容性和低毒性等，使它们适用于生物传感和成像。目前，通过调控有机分子结构已经建立了各种放大技术以提高ecl效率(φecl)，如增强吸电子基团、共振能量转移(ret)、双ret、聚集诱导发射(aie)和双分子内电子转移。值得注意的是，在光物理中，大多数有机体系都属于荧光范畴，而基于理论考虑，对荧光有机发射体φecl的增强通常受到自旋统计的约束。在电化学激发下，最低单重态(s1)产生激发态(1r*)的比例约为25％，三重态(t1)产生激发态(3r*)的比例约为75％。然而，只有1r*可以通过荧光通道进行辐射跃迁产生ecl。而占主导地位的激发三重态(3r*)则不能从t1跃迁到基态，因此不能产生ecl。相反，它会产生非辐射跃迁。因此，尽管特定的荧光有机发光体具有较高的光致发光量子产率(φpl)，但其φecl仍然受到其固有荧光特性的限制。

3、热激活延迟荧光(tadf)在实现100％激子捕获辐射跃迁方面具有巨大的应用潜力，克服了自旋禁阻带来的限制。当s1和t1之间的能带间隙(δest)极低(约0.1ev)时，tadf可以产生，并可通过t1激子到s1激子的快速反向系间窜越(risc)来获得较高的发光效率，即可通过热激活产生延迟荧光(df)和即时荧光(pf)。tadf机制已经在有机发光二极管领域得到验证。近来，在水溶液中也对tadf型共反应剂ecl进行了探索，尽管在水溶液中实现tadf ecl方面取得了重大进展，但该技术仍处于早期阶段。到目前为止，据我们所知，通过引入tadf技术来优化近红外ecl检测的潜力仍未得到探索。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种ctdna检测试剂盒及检测方法，引入tadf技术来优化近红外ecl检测。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、一种ctdna检测试剂盒，包括：用于靶标扩增的试剂，所述试剂包括第一阶段扩增试剂和第二阶段扩增试剂；所述第一阶段扩增试剂用于对靶标进行第一阶段扩增；所述第二阶段扩增试剂用于对第一阶段扩增的产物进行进一步扩增；所述第一阶段扩增试剂包括h1和exo iii；其中，h1为seq id no.1所示序列；所述第二阶段扩增试剂包括h2、dntp、dna聚合酶、cleaner g和mgcl2；其中，h2为seq id no.2所示序列；信号标记物tpa-dcpp nps，名称为7,1-双(4-(二苯基氨基)苯基)-2,3-双氰基吡嗪并菲纳米粒子；保护探针，所述保护探针为bhq3修饰的seq id no.3所示核酸序列，用于猝灭tpa-dcpp nps的ecl信号；硫代捕获探针，所述硫代捕获探针为巯基修饰的seq id no.4所示核酸序列，用于捕获所述保护探针；所述检测试剂盒用于ctdna的检测或辅助鉴定，所述检测或辅助鉴定以非疾病诊断为目的。

4、本发明还提供了一种不以疾病诊断和治疗为目的的ctdna检测方法，包括以下步骤：

5、s1.将h1、exo iii和含有靶标的溶液在37℃下共孵育50-80min，然后加热使exoiii失活，然后自然冷却至室温，得到含有primer的exo iii辅助反应体系；

6、s2.将所述exo iii辅助反应体系和h2加入到反应溶液中孵育1-3h，所述反应溶液中含有dntp、dna聚合酶、cleaner g和mgcl2，加热使dna聚合酶失活后自然冷却至室温，得到per产物；

7、s3.将硫代捕获探针溶液和保护探针溶液混合，37℃下孵育1h，形成双链捕获probe@protector探针；

8、s4.将信号标记物tpa-dcpp nps滴涂在玻碳电极上，得到tpa-dcpp nps/gce；

9、s5.在所述tpa-dcpp nps/gce上修饰au nps，得到au nps/tpa-dcpp nps/gce；

10、s6.将所述双链捕获probe@protector探针修饰在所述au nps/tpa-dcpp nps/gce上，在4℃下孵育过夜，得到probe@protector/au nps/tpa-dcpp nps/gce；

11、s7.室温下将mch作用于probe@protector/au nps/tpa-dcpp nps/gce，封闭非特异性活性位点；

12、s8.将得到的per产物与probe@protector/au nps/tpa-dcpp nps/gce孵育80-120min，在37℃下测定ecl信号。

13、进一步的，步骤s1中，h1、exo iii和含有靶标的溶液的体积比为10:5:10，其中，exoⅲ的浓度为1u/μl。

14、进一步的，步骤s2中，所述exo iii辅助反应体系、h2和反应溶液的体积比为5:5:20，所述反应溶液中，dna聚合酶的浓度为0.6u/μl。

15、进一步的，上述ctdna检测方法具体包括以下步骤：

16、步骤1、制备tpa-dcpp小分子，名称为7,1-双(4-(二苯基氨基)苯基)-2,3-双氰基吡嗪并菲，供体-共轭桥-受体-共轭桥-供体(d-π-a-π-d)结构；

17、步骤2、纳米沉淀法合成tpa-dcpp nps；所得产物呈现出球状，具有良好的分散性；tpa-dcpp nps具有d-π-a-π-d的结构，其具有优异的共反应剂型ecl。

18、步骤3、tadf增强的近红外电化学发光生物传感器的构建：

19、s1.构建exo iii辅助反应体系：将10μl h1(1μm)、5μl exo iii(1u/μl)和10μl不同浓度的靶标在37℃下共孵育60min，然后在80℃下加热10分钟使exo iii失活，然后自然冷却至室温。

20、s2.制备per产物：将5μl的exo iii辅助反应体系和5μl h2(10nm)加入到20μl的反应溶液中(0.6u/μl dna聚合酶，100nm dntp,100nm cleaner g,1×thermopol缓冲液，10mmmgcl2)孵育2h后，在80℃下热处理20min。

21、s3.将硫代捕获探针capture probe(1μm)和保护探针protector(1.5μm)在37℃下孵育1h，形成双链捕获探针(probe@protector)。

22、s4.用0.05μm al2o3粉将裸玻碳电极(gce)进行抛光打磨，然后在乙醇和二次水中连续超声处理5min。

23、s5.将步骤2中的tpa-dcpp nps(6μl)滴涂到清洗好的电极表面，然后用6μl aunps修饰。

24、s6.将双链捕获probe@protector探针(6μl)修饰在电极表面，通过au-s键进行核酸偶联，并在4℃下孵育过夜。

25、s7.室温下将巯基乙醇(mch，1μm，6μl)修饰到上述电极表面并孵育60min，用于封闭非特异性活性位点。

26、s8.将s2得到的per产物(10μl)与上述修饰的gce孵育100min，在37℃下测定ecl信号。

27、h1序列为：5’-atc tgt tgg act acg cca cta gct cca ac-3’

28、h2序列为：5’-atc tgt tgg amgmg gcc ttt tgg cmcmc tcc aac aga ttc caacag at-3’

29、capture probe序列为：5’-ttt ttt ttt tac gat ctg ttc cct ct-3’

30、protector序列为：5’-taa cca aca gat aga-3’

31、上述序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并纯化。

32、上述基于tadf增强的d-π-a-π-d结构的新型tpa-dcpp nps的阳极ecl信号检测用于ctdna定量分析应用。发夹dna1(h1)在靶标存在下可被打开形成双链配合物。exoⅲ对双链dna按照3′→5′的方向从3′-oh末端逐渐消化5′-单核苷酸。之后，靶标被释放进行下一轮的exoⅲ的消化扩增反应。同时，也产生了用于per扩增反应的目标替代物(primer)。在发夹dna2(h2)的作用下达到per级联扩增，微量靶标可以在极小的背景信号下进行指数级别扩增。capture probe@protector-bhq3双链探针通过au-s键偶联在tpa-dcpp nps修饰的电极上，而bhq3(发光猝灭剂)，由于距离接近tpa-dcpp nps，基于ecl-ret效应，有效地猝灭了tpa-dcpp nps的ecl发射。由于per产物与捕获探针(capture probe)的结合能力大于capture probe@protector-bhq3双链探针的结合能力，导致protector-bhq3从电极表面释放。因此，bhq3和tpa-dcpp nps之间的ecl-ret被破坏，进而tpa-dcpp nps的ecl发射恢复。总之，随着靶标数量的增加，bhq3的猝灭效应逐渐降低，而ecl响应逐渐恢复，为ctdna定量检测提供了一个指标。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果：

34、(1)首先合成了tpa-dcpp小分子，之后采用纳米共沉淀法制备了tpa-dcpp nps，所得产物呈现球状，且具有良好的分散性；tpa-dcpp nps具有供体-共轭桥-受体-共轭桥-供体(d-π-a-π-d)的结构，其具有优异的共反应剂ecl行为。

35、(2)以tpa-dcpp nps作为ecl发光体，bhq3作为发光猝灭剂，基于“ecl-ret”效应，以ctdna作为检测靶标构建了ecl生物传感器，借助exoⅲ辅助per级联扩增技术，通过循环放大作用将靶标信号进行了放大，提高了生物传感器的检测灵敏度，有助于痕量ctdna的灵敏检测。此外，所提出的策略在检测水溶液和人血清中的ctdna方面表现出优异的特异性、灵敏度和可靠性。

36、(3)与普通的近红外发光体(bset-bt nps)相比，由于tpa-dcpp nps的tadf特性，显著提高了其ecl发光效率，ecl效率的提高表明tadf在提高ecl效率和促进生物传感应用方面具有重要的应用价值。