逆转肿瘤微环境的融合蛋白及其应用的制作方法

本发明属于免疫治疗，具体涉及一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白、一种新型肿瘤免疫抑制抵抗型car以及表达载体、免疫细胞和应用。

背景技术：

1、car全称是嵌合抗原受体，car-t是嵌合抗原受体t细胞即表达嵌合抗原受体(car)的t淋巴细胞，目前car-t治疗在血液系统肿瘤中取得了突破性进展，但在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为car-t较难进入实体瘤内部，一方面即便car-t细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响car-t细胞在实体瘤治疗的疗效；肿瘤微环境与肿瘤的发生、生长和转移有着密切关系，近年来的临床研究表明，肿瘤微环境尤其是实体瘤的免疫微环境对免疫治疗(包含免疫细胞治疗)的疗效和预后都有着显著的影响。因此，car-t细胞治疗实体肿瘤，解决肿瘤微环境抑制即实施肿瘤微环境抵抗必不可少。

2、cd47作为继pd-1/pd-l1,ctla-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向cd47 scfv制备car-t进行肿瘤治疗。cd47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向cd47疗效有限，并且外源的scfv由于其强的亲和力可能会导致car-t细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别cd47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。

3、信号调节蛋白α(sirpα)是cd47的配体之一，可与cd47结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用，目前绝大多数关于cd47的研究均集中于sirpα。sirpγ也可与cd47结合，其存在于t细胞表面，胞外区由一个v结构域和两个c1结构域组成，无胞内信号，仅通过cd47传递单向信号，目前很少有研究者针对sirpγ进行改造，而我们认为其是更适合进行针对cd47进行肿瘤微环境破除的配体。因此，我们选择sirpγ蛋白的胞外段进行改造设计，并进一步设计肿瘤免疫抑制抵抗型的car。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白和包含该蛋白的表达载体和免疫细胞，所述融合蛋白可以逆转肿瘤微环境，靶向杀伤肿瘤细胞。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下方案：

3、对sirpγ蛋白的胞外段进行改造设计，得到可以破除肿瘤组织中抑制性信号的逆转肿瘤微环境的融合蛋白。

4、所述融合蛋白为sirpγ融合蛋白，所述sirpγ融合蛋白结构包含胞外段，跨膜区和胞内信号区。

5、进一步，跨膜结构来源于人cd28跨膜区或人cd8来源跨膜区。

6、进一步，所述跨膜结构氨基酸序列如seq id no:7或seq id no:8所示。

7、优选地，所述胞内信号区来源于cd28，序列如seq id no:9或seq id no:38所示。

8、进一步，所述sirpγ融合蛋白的结构为sirpγ-cd28tm-cd28、sirpγ-cd8tm-4-1bb。

9、进一步，所述sirpγ胞外段氨基酸序列如seq id no:1或其功能性变体所示。

10、进一步，所述sirpγ融合蛋白sirpγ-cd28tm-cd28的氨基酸序列为seq id no:2或其功能性变体所示。

11、进一步，所述sirpγ融合蛋白sirpγ-cd8tm-4-1bb的氨基酸序列为seq id no:3或其功能性变体所示。

12、进一步，所述sirpγ融合蛋白为sirpγ-cd28tm-cd28的核苷酸序列如seq id no:13所示。

13、进一步，所述sirpγ融合蛋白sirpγ-cd8tm-4-1bb的核苷酸序列如seq id no:14所示。

14、进一步，包含所述表达载体的免疫细胞。

15、进一步，所述免疫细胞为t细胞、t细胞前体或nk细胞。

16、具体的所述的t细胞可以是αβt细胞，也可以是γδt细胞；γδt细胞是一群表面含有受体γ和δ链的独特的t细胞亚群，占所有t淋巴细胞的0.5-5％，该细胞群于1987年首次发现。其虽然具有γδtcr，但是其识别抗原或配体为非mhc限制的，与传统的αβt细胞不同。目前已经有cn107810267a和cn107771215a等多篇专利公开将γδt细胞应用于细胞治疗和car-t细胞治疗中。

17、具体的，在设计sirpγ融合蛋白的同时还设计了pd-1的融合蛋白pd-1-28tm-28、pd-1-8tm-bb。

18、具体地，所述设计的sirpγ融合蛋白在与car1联合应用时，既可单独表达，也可以与car1共同表达发挥作用。并且所述sirpγ融合蛋白也可单独应用到免疫治疗中。

19、具体地，本发明中，发明人认为sirpγ蛋白更适合进行针对cd47进行肿瘤微环境破除的配体。因此，选择sirpγ蛋白的胞外段进行改造设计，并进一步设计肿瘤免疫抑制抵抗型的car；因此本发明创造性的将设计构建的缺氧可调控启动子联合car-t细胞技术和缺氧可调控启动子、sirpγ蛋白联合car-t细胞技术应用到肿瘤的免疫治疗当中，即进一步对传统的car结构进行改造，提高car-t在实体瘤上的治疗药效及car-t的安全性。

20、进一步，所述免疫细胞还包含具有识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体结构，所述嵌合抗原受体包含识别肿瘤抗原的胞外段、hinge区、跨膜区和胞内信号区，其中肿瘤抗原包含但不限于psca、psma、cd19、bcma、cd123、cd20、cd22、cea、egfr、egfrviii、gpc3、5t4、cd33、her2、gd2、cd70、cll-1、trop2、cd47、gpc3、clnd18.2、cd133、cs1、cd155、cd30、ror1、muc1、il13raα2或mesothelin等可以作为肿瘤靶向性识别的抗原分子。

21、本发明的目的在于还提供一种新型肿瘤免疫抑制抵抗型car，以及包含所述car的表达载体和免疫细胞。所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型car和免疫细胞破除肿瘤组织中抑制性信号对car-t功能的影响，实现了car-t治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。

22、为实现上述目的，本发明采用以下方案：

23、所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型car包含目的一所述的逆转肿瘤微环境的融合蛋白和car1，所述car1包含识别肿瘤抗原的胞外段、hinge区、跨膜区和胞内信号区。

24、进一步，所述融合蛋白通过多顺反子结构与car1连接，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点ires，所述自剪切多肽为t2a、p2a、e2a或f2a。

25、进一步，所述car的结构为scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ融合蛋白或scfv-hinge-tm-4-1bb-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ融合蛋白。

26、进一步，所述car的结构为scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ-cd28tm-cd28或scfv-hinge-tm-4-1bb-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ-cd28tm-cd28。

27、进一步，所述car结构a可以是常规的第一代、第二代、第三代car结构，也可以是改进的双car、可调控car结构(如frb/fkbp12调控)等新型car结构。

28、进一步，car1中的铰链区序列可以来源于：igg、cd8、cd7、cd4；car结构中跨膜区可以来源于：cd8、cd28、cd3ε、cd4、cd16、cd137、cd80以及cd86；car结构中胞内信号区可来源于：cd3、cd137、cd28、cd27、ox40、icos、gitr、cd2、cd40、pd-1、pd1l、b7-h3、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、icam-1、cd7、nkg2c、cd83、cd86以及cd127。

29、进一步，所述scfv可以识别cd19、cd123、mov-γ、psma、il13rα2、egfrviii、egfr、epcam、gd2、muc1、her2、gpc3、cea、meso、cd133、nkg2d、cd138、ley、k-light、cd33、ror1、bcma、cd30、cd20、cd22、psca、cll-1、cd70、cd47中的任一种。

30、进一步，所述scfv可以识别cd47或cea或psca或cd19或bcma。

31、在某些实施例中，所述car结构带有截短的egfrt调控标签；在某些实施例中，所述靶向psca的car结构为通用型car结构；在某些实施例中，所述靶向psca的car结构带有自杀基因如icasp9。

32、在某些实施例中，所述car结构包含天然杀伤细胞受体(nkr)的一种或多种组分，因而形成nkr-car。nkr组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，例如kir2dl1、kir2dl2/l3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、dir2ds5、kir3dl1/s1、kir3dl2、kir3dl3、kir2dp1和kir3dp1；天然细胞毒性受体(ncr)，例如，nkp30、nkp44、nkp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族，例如，cd48、cd229、2b4、cd84、ntb-a、cra、blame和cd2f-10；fc受体(fcr)，例如，cd16、和cd64；和ly49受体，例如，ly49a、ly49c。所述的nkr-car分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，dap12)相互作用。

33、作为一种优选方案1，前述的sirpγ融合蛋白的和car1组成的car结构，其中，所述car1包含：hinge的氨基酸序列如seq id no:24或其功能性变体所示，tm的氨基酸序列如seq id no:7或seq id no:8，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:11或其功能性变体所示所示；融合蛋白结构：融合蛋白结构：sirpγ的胞外段的氨基酸序列如seq id no:1或功能性变体所示；来源于人cd28的跨膜区氨基酸序列如seq id no:7所示；来源于人cd28的胞内信号区氨基酸序列如seq id no:9所示。

34、进一步，所述scfv的氨基酸序列如seq id no:25所示或其功能性变体。

35、具体的，本优选方案设计了表达新型免疫抑制抵抗型car：scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ-28tm-28，scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ-8tm-bb，scfv-hinge-tm-4-1bb-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ-28tm-28，scfv-hinge-tm-4-1bb-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ-8tm-bb以及scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-pd-1-28tm-28和scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-pd-1-8tm-bb的基因修饰的t淋巴细胞验证新型免疫抑制抵抗型car的作用。

36、进一步，制备所述的car的结构的方法为，将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。

37、作为一种优选方案2，前述的sirpγ融合蛋白的和car1组成的car结构，其中，所述car1包含抗cea单链抗体、cd8铰链区、cd8跨膜区、cd137和cd3ξ双刺激信号。

38、优选地，所述car结构a为cea scfv-cd8铰链区-cd8跨膜区-cd137-cd3ξ结构，其氨基酸序列包含如seq id no：26所示的序列。其中，编码cea单链抗体的核酸序列如seq idno：36所示；编码cd8铰链区-cd8跨膜区-cd137-cd3ξ结构的核酸序列如seq id no：37所示。

39、进一步，编码包含缺氧可调控的启动子的所述car结构的核酸序列包含如seq idno：31所示的序列。

40、作为一种优选方案3，前述的sirpγ融合蛋白的和car1组成的car结构，其中，所述car1包括cd19单链抗体、cd8铰链区、cd8跨膜区、cd137和cd3ξ双刺激信号；

41、优选地，所述car结构a氨基酸序列如seq id no：27所示或其功能性变体。

42、进一步，编码所述car结构的核酸序列包含如seq id no：32或seq id no：33所示的序列。

43、进一步，制备所述的car的结构的方法为，将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。

44、作为一种优选方案4，前述的sirpγ融合蛋白的和car1组成的car结构，其中，所述car结构a包括psca单链抗体、铰链区、cd28跨膜区、cd28、cd137和cd3ξ三刺激信号；所述铰链区为g4h或7h。

45、优选地，所述car结构a氨基酸序列如seq id no：28所示或其功能性变体；或如seqid no：29所示或其功能性变体。氨基酸序列如seq id no：28所示或其功能性变体为铰链区为g4h的car结构a；氨基酸序列如seq id no：29所示或其功能性变体为铰链区为7h的car结构a。

46、进一步，编码所述car结构的核酸序列包含如seq id no：34或seq id no：35所示的序列；其中seq id no：35包含了缺氧可调控的启动子。

47、进一步，制备所述的car的结构的方法为，将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。

48、作为一种优选方案5，包含前述的sirpγ融合蛋白，和优选方案1-优选方案4中的任一一种car1组成car结构，所述car结构还包括缺氧启动子，所述缺氧可调控启动子的核酸序列包含如seq id no：30所示的序列。包含缺氧启动子的靶向cd19的car结构能够在缺氧微环境中有效的清除体内肿瘤作用,并且利用缺氧微环境诱导的启动子能够在缺氧环境强化目的基因、蛋白等因子的表达，提高肿瘤的药物疗效和car-t治疗的有效性和安全性，而且不仅可以有效的表达于t淋巴细胞，而且在缺氧环境中能够加强car分子表达，并且使car-t细胞有高的ifn-γ分泌能力，提高car-t细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗。

49、进一步，所述缺氧可调控启动子，由hifla调节元件和迷你启动子连接构成；所述迷你启动子选自细胞病毒启动子、hsv胸苷激酶的启动子、猿猴病毒40的启动子、腺病毒晚期启动子和合成启动子中的任一项。

50、进一步，制备所述的car的结构的方法为，将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。

51、本发明目的在于还提供一种包含前任一所述的新型肿瘤免疫抑制抵抗型car(包括优选方案1-优选方案5中的方案和非优选地方案)的表达载体、包含该表达载体的免疫细胞。

52、进一步，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体，rna载体、质粒中的任一种。

53、进一步，所述免疫细胞为t细胞、t细胞前体或nk细胞。

54、进一步，制备所述的免疫细胞的方法为，将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述sirpγ融合蛋白的car结构和所述sirpγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。

55、在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，vmv)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。

56、在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒ltr、psi(ψ)包装信号、中心多嘌呤段/dna瓣(cppt/flap)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的car的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒ltr。

57、在某些实施例中，car包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)或土拔鼠转录后调节元件(wpre)以及优化的土拔鼠转录后调节元件(opre)。

58、在某些实施例中，所述5'ltr的启动子经异源启动子置换。

59、在某些实施例中，所述异源启动子是巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，rsv)启动子或猿猴病毒40(sv40)启动子。

60、在某些实施例中，所述5'ltr或3'ltr是慢病毒ltr。

61、在某些实施例中，所述3'ltr是自我失活(sin)ltr。

62、在某些实施例中，所述car结构的核酸序列包含优化的kozark序列。

63、在某些实施例中，可操作地连接到编码本文所涵盖的car的多核苷酸的所述启动子以及以下组成的群组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(cmv)、延伸因子1α启动子(ef1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(pgk)、泛素-c启动子(ubq-c)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(cag)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(mc1)、β肌动蛋白启动子(β-act)、猿猴病毒40启动子(sv40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(mnd)启动子。

64、在某些实施例中，包含car的载体可以包含分泌型抗pd-1scfv；在某些实施例中，包含car的载体包含pd-1共轭转导肽(如pd-1-cd28-cd137-cd3信号结构)；在某些实施例中，包含car的载体多个car组合，如2个靶向不同抗原或同一抗原的不同识别位点的car组合。

65、本发明的目的在于还提供了一种药物组合物及其应用。

66、为实现上述目的，本发明采用以下方案：

67、所述药物组合物包含所述的融合蛋白或包含所述融合蛋白的表达载体和免疫细胞或所述的新型肿瘤免疫抑制抵抗型car或包含所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型car所述的免疫细胞。

68、在某些实施例中，融合蛋白可以选择sirpα或者sirpα的部分结构域，融合蛋白的结构可以是sirpα-28tm-28，sirpα-8tm-137，sirpα-8tm-ox40、sirpα-8tm-icos等多种融合蛋白。在有些实施例中可以单独使用表达上述sirpα融合蛋白的免疫细胞，也可以将上述sirpα融合蛋白和car分子共表达于同一免疫细胞；或分别表达sirpα融合蛋白、car分子的免疫细胞以一定比例混合。

69、在某些具体实施例中，所述活性剂和/或治疗可以是手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和fk506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如campath、抗cd3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、fr901228、细胞因子和辐射。

70、在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强car表达细胞活性的活性剂。活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如pd1可以在一些实施方案中降低car表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit,lair1、cd160、2b4、ceacam(ceacam-1、ceacam-3、ceacam-5)、lag3、vista、btla、tig、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷、tgfr(tgfrβ)和tgfrβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如pd1 car。

71、进一步，种前任一所述的融合蛋白或前任一所述的car结构或前任一所述的核酸序列或前任一所述的表达载体或前任一所述的免疫细胞在制备肿瘤药物中的应用。

72、进一步，所述肿瘤为恶性肿瘤，包括急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和皮肤癌。

73、在本发明中，在car结构中，z是指人cd3胞内信号cd3ζ，bb是指人4-1bb胞内信号，bbz是指4-1bb icd-cd3ζ的胞内结构域，28z是指cd28 icd-cd3ζ的胞内结构域。

74、本发明中，所述“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。

75、本发明中，在car结构中，ceaz是指胞内结构仅有cd3ζ的靶向cea的car结构，cea-28z是指胞内具有来源cd28胞内域的共刺激信号和cd3ζ的靶向cea的car结构，cea-bbz是指胞内具有来源4-1bb胞内域的共刺激信号和cd3ζ的靶向cea的car结构，bcma-bbz是指胞内具有来源4-1bb胞内域的共刺激信号和cd3ζ的靶向bcma的car结构；sirpγ-28tm-28是指胞内仅有来源cd28胞内域信号的sirpγ融合肽，使用sirpγ-28简写；sirpγ-8tm-bb是指胞内仅有来源4-1bb胞内域信号的融合肽，使用sirpγ-bb简写。

76、本发明的有益效果在于：

77、本发明提供的逆转肿瘤微环境的融合蛋白可以逆转肿瘤微环境，靶向杀伤cd47阳性的的肿瘤细胞；包含所述融合蛋白的新型肿瘤免疫抑制抵抗型car和免疫细胞破除肿瘤组织中抑制性信号对car-t功能的影响，实现了car-t治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。