一种棉花谷胱甘肽硫转移酶基因GhGSTU19及其应用

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19及其应用。

背景技术：

1、棉花作为最重要的农作物之一，生产天然的纺织工业原料，每年带动全球60亿元的纺织工业产业链，保证2千万个产业工人就业。近年来我国棉花种植面积逐年下降，生产成本相对于美国进口棉居高不下。生产成本高的主要原因是棉花种植机械化程度不高导致的人工成本高。机械化播种对水分的控制要求高，而我国棉花主要产区处于西北内陆，主要集中在新疆地区，多有干旱、高盐碱等自然条件限制。苗期干旱使棉花产量降低，纤维品质下降。因此如何提高棉花品种对干旱等逆境胁迫的耐受力，对降低我国棉花种植成本，进一步增强在国际上的竞争力具有重要的意义。培育干旱耐受性棉花品种是我国棉花生产的迫切要求。

2、近年来，棉花的基因组学和功能基因组学的发展为分子设计育种打开了新的道路，对主要耐旱基因的识别和应用可以直接指导棉花精准设计育种。干旱胁迫对棉花产生复杂的影响，包括种子萌发率、苗期子叶含水量、叶片光谱和光合效率。这些生理现象，引起清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量的变化。目前棉花耐旱性相关的分子遗传研究还是主要围绕着胁迫诱导基因。这类胁迫诱导基因主要可以分为以代谢功能为主的渗透调节型基因、胁迫信号转导基因和耐旱相关转录因子。在棉花基因组中，参与渗透调节作用的基因包含有脯氨酸代谢途径中的吡咯琳-5-羧酸合成酶、海藻糖代谢、水通道蛋白等。非生物胁迫信号转导基因包括受体激酶gbrlk，ghmkk1，ghmpk6a，ghmkk5，ghmap3k40，胁迫响应基因ghrdl1等。棉花干旱调控的转录因子研究主要集中在wrky转录因子基因家族ghwrky27a，ghwrky25，ghwrky41，ghwrky17，ghwrky15，ghwrky3。另外，植物对干旱胁迫进行调节的aba信号途径中的nac类转录因子在棉花中也可能具有重要功能。

3、谷胱甘肽硫转移酶gsts是一个多功能酶的超基因家族，普遍存在于动植物体内。1970年研究人员首次发现玉米gsts能够催化谷胱甘肽（gsh）与之偶联从而消除了除草剂对玉米的毒性作用。由此，国内外学者对不同植物中的gsts基因家族开始进行分析研究。基于序列和结构相似性，植物中的gsts可分为tau（u）、phi（f）、theta（t）、zeta（z）、lambda（l）、ef1bγ、脱氢抗坏血酸还原酶（dhar）、四氯代氢醌脱卤素酶（tchdq）、蚯蚓血红蛋白和ⅰ类共十种不同亚类，其中tau、phi、lambda和dhar等四类为植物所特有，且tau和phi两类最为丰富。现今，已对拟南芥、大豆、小麦、大麦、香蕉等多种植物的gsts基因家族进行了全基因组鉴定。

4、植物gsts存在于胞质、线粒体和微粒体中。大多数gsts以同源二聚体、异源二聚体或单体的形式存在，构成二聚体亚基的分子量大小在25-27 kda范围内。每个亚基都有一个谷胱甘肽特异性结合位点（g位点）和一个疏水底物结合位点（h位点）。g位点位于多肽链高度保守的n端结构域，h位点所在的c端结构域则结构多样。tau、phi、zeta和theta类gsts的活性位点上存在一个丝氨酸残基，它能与谷胱甘肽的硫醇基相结合而催化gsh；lambda和dhar类gsts的活性位点上不存在丝氨酸残基，而是存在半胱氨酸残基，它能与gsh结合形成二硫化物。据研究，除g位点和h位点外，tau类gsts可能还存在另一个配体结合位点（i位点），使其能够作为非催化的配体或结合蛋白，防止体内分子氧化和有毒物质损害。植物gsts具有解毒功能，它催化gsh的巯基与内源或外源化合物的亲电基团结合偶联，使受gsh标记的衍生物排出或分隔，以保护细胞免受损伤。gsts还能作为植物激素和花青素的配体或结合蛋白，促进物质的分布和运输。因此gsts不仅在植物适应性中的功能具有重要的意义，在提高作物适应性等应用中也具有重要的意义。

5、在棉花中，已有研究对陆地棉、海岛棉、草棉进行gsts全基因组分析。在陆地棉中，鉴定到ghgstf1、ghgstf2、ghgstf8和ghgstf12与花青素的转运和积累有关，ghgstf4、ghgstf6和ghgstf9的功能可能与生长调节和胁迫相应有关。陆地棉a亚基因组的9号染色体上的tau类gsts簇中的关键基因gh_a09g1508、gh_a09g1509和gh_a09g1510对黄萎病抗性有重要作用。在草棉中，phi类谷胱甘肽硫转移酶gagstf9能正调节棉花黄萎病抗性。而在棉花的抗旱、耐盐碱等非生物胁迫方面，从gsts功能入手的应用还未有报道研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种对棉花耐旱性具有调控功能的棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19及其应用，并且通过基因工程对该基因的表达活性进行调整，以有效达到提高棉花耐旱性的目的，此外，还根据该基因在植物基因组的保守功能，推广至单子叶和双子叶植物耐旱性改良应用。

2、本发明的目的之一在于提供一种棉花干旱适应性调节的棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19，其核苷酸序列在四倍体陆地棉（g. hirsutum）tm-1a亚组中如seq id no.1所示。

3、本发明目的之二在于提供所述棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19的扩增方法及两组重组质粒。

4、其中，扩增所用的引物对如下：

5、gst-f:tggaaggtatgcgccaaatg（如seq id no.3所示）；

6、gst-r:ataggtgtcggtgttccctg（如seq id no.4所示）。

7、一种重组质粒vigs-trv2-ghgstu19，所述重组质粒沉默所述棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19，具体地，将棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19序列连接到中间载体vigs-trv2所得。构建重组质粒vigs-trv2-ghgstu19所用的扩增引物对为：

8、xf155-f：5’gtgagtaaggttaccgaattcttatgtgattatgtcaagaaagacgtagg 3’

9、xf155-r：5’cgtgagctcggtaccggatccgaacaggtttcgtctgcaacagt 3’

10、本发明提供一种重组质粒35s-ghgstu19-gfp，所述重组质粒过表达所述棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19，具体地，将棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19序列连接到中间载体pbingfp4所得。构建重组质粒35s-ghgstu19-gfp所用的扩增引物对为：

11、xf151-f：5’gaacgatagggtacccccgggatggcagaggaagtagtattgctaga 3’

12、xf151-r：5’gcccttgctcaccatggatccgtgtagttgatttttcctattccatttg 3’

13、本发明目的之三在于提供所述棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19、所述扩增引物对或所述重组质粒vigs-trv2-ghgstu19和35s-ghgstu19-gfp在基因工程中的应用，特别是在调控单子叶和双子叶植物耐旱能力或开发耐旱单子叶和双子叶农作物新品种中的应用，更优选的是在提高棉花、拟南芥耐旱性能或在培育耐旱棉花新品种中的应用。

14、本发明所述的应用，具体为：

15、在单子叶和双子叶植物中过表达所述棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19以提高单子叶和双子叶植物耐旱能力；将重组质粒vigs-trv2-ghgstu19转染到野生型棉花品种中，可显著减弱野生型棉花品种的耐旱能力。

16、在单子叶和双子叶植物中沉默所述棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19以减弱单子叶和双子叶植物耐旱能力；将重组质粒35s-ghgstu19-gfp转染到野生型拟南芥品种中，可显著提高野生型拟南芥品种的耐旱能力。

17、本发明目的之四在于提供一种构建耐旱棉花新品种的方法，具体为：

18、将棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19克隆并构建过表达载体，再通过转基因技术将过表达载体转染到野生型棉花品种中，获得棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19过表达植株即为耐旱棉花新品种。

19、本发明的有益效果是：

20、通过对实验结果的统计分析发现，棉花谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19在棉花干旱胁迫中受到诱导表达。

21、对棉花进行干旱处理数天后，经vigs沉默ghgstu19的植株的耐旱性较野生型更敏感，且复水后的再恢复性也较弱。对处理过程中的棉花叶片用扫描电镜观察超微结构，发现沉默后的棉花叶片细胞中，叶绿体损伤程度更大。

22、本发明通过基因工程获得35s-ghgstu19-gfp转基因拟南芥，渗透胁迫后拟南芥生长正常并显著优于野生型。35s-ghgstu19-gfp转基因拟南芥干旱耐受性增加。

23、这些结果表明谷胱甘肽硫转移酶基因ghgstu19可以参与棉花干旱耐受适应性分子调控。