添加剂及其在提高肿瘤细胞分泌铁蛋白中的应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及添加剂及其在提高肿瘤细胞分泌铁蛋白中的应用。

背景技术：

1、铁蛋白的分子结构是由一层蛋白壳围绕着铁和磷酸盐分子组成的铁核，外径12～13nm，分子量500kda。铁蛋白具有耐稀酸(ph值2.0)、耐稀碱(ph值12.0)、耐较高温度(70～75℃水温下不变性)等特殊性质。在很多研究中，就是利用铁蛋白的这些特性，从动物组织中提纯出该蛋白。典型的铁蛋白结构是由蛋白外壳和铁内核两部分构成，其中蛋白外壳是由24个亚基自组装形成的笼状结构(外径12nm，内径8nm)，铁内核的主要成分为水铁矿(5fe2o3·9h2o)。铁蛋白外壳通常是由两种蛋白亚基(h和l)组成。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有h和l亚基的比例有所不同。血清铁蛋白是临床用于缺铁性贫血诊断、治疗和疗效监测的重要参考指标，还可以作为多种疾发生、发展的重要生物学标志物，如急性炎症反应标志物，自身免疫性疾病的重要指标，嗜血细胞综合症的辅助诊断标志物，肿瘤性疾病的重要标志物，代谢性疾病的重要标志物等。

2、铁蛋白是体内含量丰富的蛋白质，通常可以从人或动物心、肝、脾、肾等组织中提取，但涉及人源性或动物源性物料，存在难收集和生物安全风险。一些肿瘤细胞可以分泌表达天然铁蛋白，因此，采用从肿瘤病人的分离肿瘤细胞进行培养，可以获得天然铁蛋白，但是分泌量较低，产量和效价不能满足生产需求，局限于实验室使用，不能大规模使用。因此，提供能够用于提高肿瘤细胞表达铁蛋白表达量的方法是目前需要解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供添加剂及其在提高肿瘤细胞分泌铁蛋白中的应用，

2、本发明提供的添加剂组合，包括添加剂1和添加剂2，其中：

3、添加剂1由l-谷氨酰胺、胰岛素和转铁蛋白组成；

4、添加剂2由葡萄糖、l-谷氨酰胺、柠檬酸铁、乙醇胺和丁酸钠组成。

5、本发明根据肿瘤细胞生长的需要，在培养过程中加入添加剂，从而提高肿瘤细胞分泌铁蛋白的水平。本发明的添加剂经过筛选和优化，相对于其他添加剂的方案，能够更有效的提高铁蛋白的产量。本发明所述的添加剂1和添加剂2独立的为粉末状态或为溶液状态，本发明对此不做限定，二者可皆为粉末状态，也可皆为溶液状态，也可为一者为粉末状态，一者为溶液状态。

6、本发明实施例中，所述添加剂1中：l-谷氨酰胺、胰岛素和转铁蛋白的摩尔比为(2～4):(10～20):(1～1.5)。研究表明，在如上比例范围内，添加剂1能够更好的提供细胞营养，保证铁蛋白的分泌表达。一些实施例中，l-谷氨酰胺、胰岛素和转铁蛋白的摩尔比为2:10:1，或者l-谷氨酰胺、胰岛素和转铁蛋白的摩尔比为3:15:1.25，或者l-谷氨酰胺、胰岛素和转铁蛋白的摩尔比为4:20:1.5。

7、本发明中，所述添加剂1以溶液形式存在，其溶剂为水。所述添加剂1以高于工作浓度的浓度存在于溶液中。本发明所述的工作浓度为添加剂的组分在培养液中的终浓度。作为优选，添加剂1的浓度为工作浓度的2～100倍，例如，其为工作浓度的2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。

8、一些实施例中，所述添加剂1还包括水：

9、l-谷氨酰胺的工作浓度为2mm～4mm；

10、胰岛素的工作浓度为10mm～20mm；

11、转铁蛋白的工作浓度为1mm～1.5mm。

12、一些实施例中，添加剂1中l-谷氨酰胺的工作浓度为2mm，另一些实施例中，添加剂1中l-谷氨酰胺的工作浓度为3mm；另一些实施例中，添加剂1中l-谷氨酰胺的工作浓度为4mm。

13、一些实施例中，添加剂1中胰岛素的工作浓度为10mm，另一些实施例中，添加剂1中胰岛素的工作浓度为15mm；另一些实施例中，添加剂1中胰岛素的工作浓度为20mm。

14、一些实施例中，添加剂1中转铁蛋白的工作浓度为1mm，另一些实施例中，添加剂1中转铁蛋白的工作浓度为1.25mm；另一些实施例中，添加剂1中胰岛素的工作浓度为1.5mm。

15、本发明实施例中，所述添加剂2中：葡萄糖、l-谷氨酰胺、柠檬酸铁、乙醇胺和丁酸钠的摩尔比为(13～23):(2～4):(0.20～0.62):(100～200):(0.5～1)。试验表明，添加剂2中各组分缺一不可，且如前所述组分选择为最佳选择，各组分的配比在如上所述的范围内能够获得更好的促进铁蛋白分泌的效果。一些实施例中，添加剂2中葡萄糖、l-谷氨酰胺、柠檬酸铁、乙醇胺和丁酸钠的摩尔比为13.88:2:0.20:100:0.5；另一些实施例中，添加剂2中葡萄糖、l-谷氨酰胺、柠檬酸铁、乙醇胺和丁酸钠的摩尔比为18.04:3:0.41:150:0.75；另一些实施例中，添加剂2中葡萄糖、l-谷氨酰胺、柠檬酸铁、乙醇胺和丁酸钠的摩尔比为22.20:4:0.61:200:1。

16、本发明中，所述添加剂2以溶液形式存在，其溶剂为水。所述添加剂2以高于工作浓度的浓度存在于溶液中。本发明所述的工作浓度为添加剂的组分在培养液中的终浓度。作为优选，添加剂2的浓度为工作浓度的2～100倍，例如，其为工作浓度的2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。

17、一些实施例中，所述添加剂2中还包括水：

18、葡萄糖的工作浓度为2.5mg/ml～4mg/ml；一些实施例中，添加剂2中葡萄糖的工作浓度为2.5mg/ml，另一些实施例中，添加剂2中葡萄糖的工作浓度为3.25mg/ml；另一些实施例中，添加剂2中葡萄糖的工作浓度为4mg/ml。

19、l-谷氨酰胺的工作浓度为2mm～4mm；一些实施例中，添加剂2中l-谷氨酰胺的工作浓度为2mm，另一些实施例中，添加剂2中l-谷氨酰胺的工作浓度为3mm；另一些实施例中，添加剂2中l-谷氨酰胺的工作浓度为4mm。

20、柠檬酸铁的工作浓度为50μg/ml～150μg/ml；一些实施例中，添加剂2中柠檬酸铁的工作浓度为50μg/ml，另一些实施例中，添加剂2中柠檬酸铁的工作浓度为100μg/ml；另一些实施例中，添加剂2中柠檬酸铁的工作浓度为150μg/ml。

21、乙醇胺的工作浓度为100mm～200mm；一些实施例中，添加剂2中乙醇胺的工作浓度为100mm，另一些实施例中，添加剂2中乙醇胺的工作浓度为150mm；另一些实施例中，添加剂2中乙醇胺的工作浓度为200mm。

22、丁酸钠的工作浓度为0.5mm～1mm。一些实施例中，添加剂2中丁酸钠的工作浓度为0.5mm，另一些实施例中，添加剂2中丁酸钠的工作浓度为0.75mm；另一些实施例中，添加剂2中丁酸钠的工作浓度为1mm。

23、进一步的，本发明还提供了如前所述的添加剂组合在提高肿瘤细胞分泌铁蛋白中的应用。

24、更进一步的，本发明还提供了一种铁蛋白的制备方法，其包括：

25、将复苏后的肿瘤细胞接种至含有添加剂1的培养基，经培养1～10天后，补加添加剂2，继续培养后，收集含有铁蛋白的上清液。

26、本发明所述肿瘤细胞为表达铁蛋白的肿瘤细胞。特别是在上清液中分泌表达铁蛋白的肿瘤细胞，一些实施例中，所述肿瘤细胞为哺乳动物的肿瘤细胞，例如，其为乳腺癌细胞、肝癌细胞或肺癌细胞。更具体的，本发明以人乳腺癌细胞hs 578t为例进行铁蛋白表达的验证。

27、本发明所述肿瘤细胞在培养前经过复苏，所述复苏包括：冻存的细胞于37℃震荡温育150～190s后，与预热的培养基混合，静置培养。所述培养基为含10％新生牛血清的dmem培养基。其中所述新生牛血清为特级新生牛血清。所述静置培养的条件包括16～40℃，2％～10％co2培养2～5天。优选为37℃，5％co2培养3天。

28、本发明所述接种的接种密度为(1×105cells/ml～2×105cells/ml，计数细胞活率不低于80％，优选为90％以上。一些实施例中，所述培养基为含10％新生牛血清的dmem培养基。其中所述新生牛血清为特级新生牛血清。

29、一些实施例中，所述在含有添加剂1的培养基中培养4天，补加添加剂2后继续培养至细胞80％以上死亡进行收获。

30、一些实施例中，所述上清液的收集包括：4℃，8000rpm离心20min，收集培养上清。

31、本发明通过对添加剂的优化，获得了一个添加剂组合，其中添加剂1由l-谷氨酰胺、胰岛素和转铁蛋白组成；添加剂2由葡萄糖、l-谷氨酰胺、柠檬酸铁、乙醇胺和丁酸钠组成。利用该添加剂的组合，能够有效延长细胞维持周期，同时促进细胞分泌蛋白，提高目标蛋白的表达量。