酶切打断用平衡剂、酶切建库试剂和方法与流程

本发明涉及基因测序，具体涉及酶切打断用平衡剂、酶切建库试剂和方法。

背景技术：

1、当前，基因测序（ngs）市场对于酶切建库试剂的需求量日益增加。但是，fs酶对于打断体系的edta高度敏感，对反应溶剂有严格要求，样本只能溶于1x te buffer或者溶于水中，否则dna片段化结果会较理论值有明显偏差。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种酶切打断用平衡剂、酶切建库试剂和方法，能够调节fs酶切片段化体系对edta的敏感性，兼容不同溶剂，且使用方便。

2、本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种酶切打断用平衡剂，所述平衡剂是一种包含有金属离子和edta的混合型溶液。

4、优选地，所述平衡剂含edta和ca2+，对于基于dnase i的打断体系能够调整对于edta的敏感性。优选地，edta与ca2+的摩尔比为1：1~1：5。

5、优选地，所述金属离子至少含有ca2+。另外，所述金属离子还可以包含fe3+、al3+、cr3+，添加的金属离子浓度在2~10 mm。

6、本发明还可以提供一种酶切建库试剂，包括溶剂、建库用酶以及含金属离子和edta的酶切打断用平衡剂。

7、在其中一些实施例中，所述溶剂可以为水，所述溶剂还可以为ph 7~9的tis-hcl缓冲液、1x te buffer、buffer eb（白垩纪，cna003901）、low-edta te buffer。

8、优选地，所述建库用酶为包含有dnase i等dna片段化的核酸酶、进行末端补平作用的聚合酶、包含有能够进行3’末端添加da碱基的taq酶等。

9、进一步地，所述酶切建库试剂盒还包括 fs pro buffer i、fs pro enzymes ii、fs pro ligation buffer ii、ligase enzymes、2x pcr mix等必要建库试剂。

10、本发明还提供一种酶切建库方法，包括如下步骤：获取dna样本；采用上述酶切建库试剂对所述dna样本进行片段化处理，得到片段化的dna；对所述片段化的dna进行末端补平，并在3’末尾添加da碱基；再对补平和加a处理后的dna的两端添加测序接头，纯化dna；通过pcr富集纯化后的dna，得到可以进行上机测序的dna片段文库。

11、其中，使用包含有片段化缓冲液和片段化酶对长度较大的dna样本进行打断；dna样本可以溶解于水、ph 7~9的tis-hcl 缓冲液、1x te buffer、 buffer eb、low-edta tebuffer等含有或者不含有edta的溶剂中。所述dna样本要求32℃条件下进行片段化和末端修复，在72℃条件下进行末端加a。

12、与现有技术相比，本发明的核心优势在于：

13、本发明通过大量试验筛选获得针对性兼容不同溶剂类型的dna样本的酶切体系，尤其是含ca2+和edta 的酶切平衡剂，能够实现dna片段化大小的一致性。

技术特征：

1.一种酶切打断用平衡剂，其特征在于，所述平衡剂含edta和金属离子，所述金属离子至少包括ca2+。

2.根据权利要求1所述的酶切用平衡剂，其特征在于，所述金属离子的应用终浓度为2~10 mm。

3.根据权利要求1或2所述的酶切用平衡剂，其特征在于，所述金属离子还包括fe3+、al3+、cr3+中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的酶切用平衡剂，其特征在于，所述edta与所述ca2+的摩尔比为1:1~1:5。

5.一种酶切建库试剂，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的酶切打断用平衡剂。

6.根据权利要求5所述的酶切建库试剂，其特征在于，还包括溶剂和建库用酶。

7.根据权利要求6所述的酶切建库试剂，其特征在于，所述溶剂为水，或者所述溶剂为ph 7~9的tis-hcl 缓冲液、1x te buffer、buffer eb、low-edta te buffer中的一种。

8.根据权利要求6所述的酶切建库试剂，其特征在于，所述建库用酶包括dnase i酶、dna片段末端补平用聚合酶、对dna的 3’末端添加da碱基的taq酶。

9.一种酶切建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的酶切建库方法，其特征在于，所述dna样本要求32℃条件下进行片段化和末端修复，在72℃条件下进行末端加a。

技术总结
本发明提供一种酶切打断用平衡剂、酶切建库试剂和方法。本发明通过大量试验筛选获得采用Ca<supgt;2+</supgt;作为酶切打断用平衡剂，并添加适量的EDTA以降低溶剂中的EDTA对整体酶活性的影响，该酶切建库方法可以使用72℃进行加A反应。与现有技术相比，采用Ca<supgt;2+</supgt;作为酶切打断用平衡剂，可以使用相同反应体系对不同溶剂的样本进行片段化，针对同一打断时间所获得的文库片段大小偏差在50bp以内。

技术研发人员：冯延叶,李艳玲,刘欢,赖煦卉
受保护的技术使用者：上海英基生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10