获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用

本发明涉及细胞分离培养，尤其涉及一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用。

背景技术：

1、神经嵴源细胞是胚胎发育过程中的一种重要细胞类型，其起源于早期胚胎发育过程中神经管背部，通过迁移至胚胎的各个部位分化成多种细胞类型，如黑色素细胞、颅面部细胞、软骨细胞、骨细胞、平滑肌细胞、中枢与外周神经元以及胶质细胞等。

2、由于神经嵴源细胞表现出较强的增殖及多向分化潜能，关于神经嵴源细胞的研究越发深入。但目前尚无从小鼠肺组织中提取原代神经嵴细胞进行体外培养的方法。有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用。本发明所述方法获取的神经嵴源细胞具有较强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，将小鼠肺组织剪切后置于细胞消化液中消化，得到细胞群；然后使用原代培养基对所述细胞群进行培养；所述细胞消化液包含2-3mg/ml的胶原酶i和0.5-1.5mg/ml的dnasei；所述原代培养基以dmem培养基作为基础培养基，添加10-25vol％的胎牛血清、终浓度80-120iu/l的青霉素-链霉素、0.8-1.2vol％的浓度为90-110mm的丙酮酸钠溶液、0.8-1.2vol％的浓度为190-210mm的l-谷胺酰胺溶液、0.8-1.2vol％的浓度为8-12mm的mem非必须氨基酸溶液和0.08-0.12vol％的浓度为50-60mm的β-巯基乙醇溶液。使用原代培养基对所述细胞群进行培养后，还包括使用流式细胞分选仪对培养获得的细胞进行分选的步骤。所述流式细胞分选仪的激发波长具有激发egfp绿色荧光和激发mtomato红色荧光的能力。

4、本发明所述方法以小鼠肺组织作为神经嵴源细胞的分离材料，先使用胶原酶i和dnasei对小鼠肺组织进行消化，然后进行流式细胞分选，再用特定的培养基对分选获得的细胞群进行培养，从而获得高纯度神经嵴源细胞。

5、本发明将小鼠肺组织剪切后置于细胞消化液中消化，其中所述剪切的方法及器材在本发明中不作特别要求，本领域常规用于组织剪切的方法及器材均可。

6、在本发明较为优选的实施方式中，剪切后的小鼠肺组织为直径约为1mm的小块。

7、优选地，在所述细胞消化液中，胶原酶i的浓度为2.5mg/ml。

8、优选地，在所述细胞消化液中，dnasei的浓度为1mg/ml。

9、优选地，在所述原代培养基中，所述胎牛血清的添加量优选为10-22vol％，更优选为10-20vol％，更优选为18-20vol％，更优选为20vol％。

10、优选地，在所述原代培养基中，青霉素-链霉素的终浓度为90-110iu/l；更优选为100iu/l。

11、优选地，在所述原代培养基中，所述丙酮酸钠溶液、所述l-谷胺酰胺溶液和所述mem非必须氨基酸(mem non-essential amino acids)溶液的添加量各自优选为0.9-1.2vol％；更优选为1.0vol％。所述β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)溶液的添加量优选为0.09-0.12vol％；更优选为0.1vol％。所述丙酮酸钠溶液的浓度优选为100mm。所述l-谷氨酰胺溶液的浓度优选为200mm。所述mem非必须氨基酸溶液的浓度优选为10mm。所述β-巯基乙醇溶液的浓度优选为55mm。

12、本发明对所述细胞消化液或所述原代培养基中的各组分来源不作特别限定，本领域常规市售来源均可。

13、进一步地，在本发明提供的一种优选的实施方式中，所述小鼠肺组织中的神经嵴源细胞具有表达egfp蛋白的能力。

14、更优选地，所述小鼠肺组织取材自具有wnt1-cre和mtomato-mgfp双杂合子的转基因小鼠。

15、在本发明提供的具体实施方式中，所述具有wnt1-cre和mtomato-mgfp双杂合子的转基因小鼠参照专利公开号：cn114946764a中记载的方法得到，包括如下步骤：(1)将杂合子wnt1-cre雄性转基因小鼠、纯合mtomato-mgfp雄性转基因小鼠分别与对应野生型转基因小鼠杂交，获得f1代杂合子wnt1-cre转基因小鼠和f1代杂合子mtomato-mgfp转基因小鼠；(2)将f1代杂合子wnt1-cre转基因小鼠和f1代杂合子mtomato-mgfp转基因小鼠进行杂交获得f2代转基因小鼠，筛选获得其中的wnt1-cre和mtomato-mgfp双杂合子的转基因小鼠即为所述永久标记神经嵴来源细胞的转基因动物；其中，wnt1-cre表示该转基因小鼠在wnt1基因控制下表达cre重组酶；mtomato-mgfp表示该转基因小鼠具有双报告基因，且在步骤(2)中cre介导重组后的细胞中表达一种报告基因，在非重组细胞中表达另一种报告基因。该来源小鼠的肺组织中可分离到egfp标记的神经嵴源细胞。

16、在该优选实施方式中，由于所述小鼠肺组织中的神经嵴源细胞具有表达egfp蛋白的能力。本发明可利用egfp蛋白的荧光特性，将神经嵴源细胞从细胞培养物中分离出来，剔除杂细胞，从而使获得的神经嵴源细胞纯度更高。

17、优选地，所述小鼠肺组织取材自矽肺造模小鼠。

18、本发明在前期的矽肺研究中发现，经矽肺造模后，矽肺模型组小鼠肺组织中发现异常聚集的神经嵴源细胞，且荧光定量显示矽肺组中egfp荧光强度高于空白组小鼠，该实验结果指示矽肺模型组中神经嵴源细胞数量高于空白组小鼠。进而使用矽肺造模后的小鼠，神经嵴源细胞的分离及纯化培养效果相较更好。

19、优选地，所述流式细胞分选仪为beckman moflo astrios eq。

20、流式细胞分选仪器和参数对分选得到的细胞纯度很重要。本发明对比了bd facss orp ariaii和beckman moflo astrios eq两种不同型号的仪器，发现bd facs s orpariaii仅具备488nm的激发波长，该波长可以同时激发egfp绿色荧光也能激发mtomato红色荧光，但是无法将两者完全区分，会导致进行分选后原代培养的egfp阳性神经嵴源细胞中混杂着mt阳性(表达mtomato蛋白)的细胞，导致神经嵴源细胞的生长受到限制，无法纯化；而beckman moflo astrios eq由于同时具备488nm和561nm的激发波长，分选后细胞纯度最高，更适合进行egfp阳性神经嵴源细胞的分选。

21、进一步地，在本发明提供的一种优选的实施方式中，使用流式细胞分选仪对培养获得的细胞进行分选后，还包括分化培养的步骤；所述分化培养使用的培养基以mem-α培养基作为基础培养基，添加10-25vol％的胎牛血清、终浓度80-120iu/l的青霉素-链霉素、0.8-1.2vol％的浓度为90-110mm的丙酮酸钠溶液、0.8-1.2vol％的浓度为190-210mm的l-谷胺酰胺溶液、0.8-1.2vol％的浓度为8-12mm的mem非必须氨基酸溶液和0.08-0.12vol％的浓度为50-60mm的β-巯基乙醇溶液。

22、优选地，在所述分化培养使用的培养基中，所述胎牛血清的添加量优选为10-22vol％，更优选为10-20vol％，更优选为18-20vol％，更优选为20vol％。

23、优选地，在所述分化培养使用的培养基中，青霉素-链霉素的终浓度为90-110iu/l；更优选为100iu/l。

24、优选地，在所述分化培养使用的培养基中，所述丙酮酸钠溶液、所述l-谷胺酰胺溶液和所述mem非必须氨基酸(mem non-essential amino acids)溶液的添加量各自优选为0.9-1.2vol％；更优选为1.0vol％。所述β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)溶液的添加量优选为0.09-0.12vol％；更优选为0.1vol％。所所述丙酮酸钠溶液的浓度优选为100mm。所述l-谷氨酰胺溶液的浓度优选为200mm。所述mem非必须氨基酸溶液的浓度优选为10mm。所述β-巯基乙醇溶液的浓度优选为55mm。

25、本发明对所述分化培养使用的培养基中的各组分来源不作特别限定，本领域常规市售来源均可。

26、第二方面，本发明提供了所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法在神经嵴源细胞生产中的应用。和其他方法获得的神经嵴源细胞相比，本发明获取的神经嵴源细胞具有相较更强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。

27、第三方面，本发明还提供了一种神经嵴源细胞的鉴定方法，以前述方法获得的神经嵴源细胞为待测样品，将待测细胞置于多聚赖氨酸包被的玻片上贴壁培养20-28h，然后使用荧光检测装置进行检测，根据检测结果判断待测细胞是否为神经嵴源细胞；判断的方法为：若检测到绿色荧光，则判断待测细胞为神经嵴源细胞。

28、有益效果：

29、本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，该方法以小鼠肺组织作为分离原料，经消化和原代培养步骤，得到高纯度神经嵴源细胞。获取的神经嵴源细胞具有较强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。另外，本发明还利用流式分选的方法分离egfp标记的神经嵴源细胞，分选后细胞纯度最高，更适合进行egfp阳性神经嵴源细胞的分选及后续培养。