一种水稻单倍体诱导方法

本发明属于生物技术和植物育种领域，具体涉及利用孤雌生殖基因诱导单倍体的方法。

背景技术：

1、水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，选育优良品种有利于保障水稻稳产增产。水稻育种过程一般需要5-10年时间，而通过双单倍体育种技术可以实现1-2代内完成品系纯化，可极大地缩短育种周期。双单倍体育种技术的第一步是获取单倍体。目前水稻中最常用的技术是花药离体培养，但是该技术对实验条件要求较高，并且受遗传背景的影响，很多品种无法培养出单倍体植株。体内单倍体诱导技术可以很好地避免以上缺陷。孤雌生殖是体内单倍体诱导技术的一个非常重要的途径。

2、水稻中目前已经报道的可以诱发卵细胞自主发育的孤雌生殖基因只有bbm1和bbm4， 其中bbm1的克隆种子诱导率较高，但是其结实率较低，且不同遗传背景之间差异巨大；另外，bbm4结实率在不同株系中差异巨大，且其诱导率也仅为3.2%。这两个基因在育种上应用均存在一定局限，急需新的孤雌生殖基因。

技术实现思路

1、本发明提供了一种水稻单倍体诱导方法，其包括以下步骤：用拟南芥卵细胞特异表达基因atec1.2的启动子诱导山柳菊（pilosella piloselloides）孤雌生殖基因pppar在水稻卵细胞中异位表达，诱导水稻进行孤雌生殖，得到水稻单倍体，所述 atec1.2的启动子的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述 pppar的核苷酸序列如seq id no.34所示。

2、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法包括以下步骤：

3、（1）载体构建:首先设计引物，用引物分别从拟南芥和山柳菊中克隆基因atec1.2的启动子和基因pppar；接着将骨架载体pub09进行酶切；最后利用多片段同源重组试剂盒，构建完整复合载体即得到重组产物；所述的重组产物核苷酸序列如seq id no.35所示。

4、（2）将上述得到的重组产物进行克隆；

5、（3）遗传转化：用农杆菌进行转化实验，获得转基因植株；

6、（4）单倍体鉴定。

7、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其载体构建步骤所设计引物为：atec1.2pro-f：aaatgttcctcgctgacgt；

8、atec1.2pro-r：acttgtgttagaagccattattct；

9、pppar-f：atggtagatgatggcaccgc；

10、pppar-r：ggcaccgtcgtcctcct；分别为seq id no.1-4所示。

11、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其载体构建步骤还包括：为两对所设计引物序列加上同源重组的接头，其中，在pppar序列之后加上3xgggs序列，引物如下：

12、atec1.2pro-fusion-f：tctagccaatacgcgagctcaagctaaatgttcctcgctgacgta；

13、atec1.2pro-fusion -r：catctaccatacttgtgttagaagc；pppar-fusion -f：taacacaagtatggtagatgatggc；

14、pppar-fusion-r：ccttgctcaccatactagtggatcttgagccacctcccgagccaccgccggaaccgccaccggcaccgtcgtcctcctccg；分别为seq id no.5-8所示。

15、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其重组产物进行克隆时，将所述重组产物转入感受态细胞dh5α中进行克隆。

16、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其遗传转化时，利用农杆菌eha105菌株介导的遗传转化方法 。

17、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其转化的水稻品种为籼粳杂交稻品种春优84。

18、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其单倍体鉴定步骤为：先利用indel标记进行初步鉴定，再将鉴定得到的单倍体用流式细胞术进一步鉴定。

19、进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其单倍体鉴定步骤，依据cy84亲本籼稻c84和粳稻春江16a设计的12对indel分子标记，区分cy84杂合子和纯合子，如果是单倍体indel条带应为单条带。

20、本发明还提供所述的水稻单倍体诱导方法在水稻育种中的应用。

21、技术效果：水稻自身不能进行孤雌生殖，也无法产生单倍体，但是单倍体诱导技术可以极大的缩短水稻育种进程，是一个非常重要的技术途径。本发明方法通过将自然界存在的山柳菊孤雌生殖基因pppar导入水稻中，通过让其在卵细胞异位表达，成功让水稻也可以进行孤雌生殖，在不影响植株生长发育的前提下，而能够诱导单倍体产生，为水稻单倍体育种提供了新的解决方案。

技术特征：

1. 一种水稻单倍体诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：用拟南芥卵细胞特异表达基因atec1.2的启动子诱导山柳菊（pilosella piloselloides）孤雌生殖基因pppar在水稻卵细胞中异位表达，诱导水稻进行孤雌生殖，得到水稻单倍体，所述atec1.2的启动子的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述pppar的核苷酸序列如seq id no.34所示。

2.根据权利要求1所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

3. 根据权利要求2所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其载体构建步骤所设计引物为： atec1.2pro-f：aaatgttcctcgctgacgt

4. 根据权利要求3所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其载体构建步骤还包括：为两对所设计引物序列加上同源重组的接头，其中，在pppar序列之后加上3xgggs序列，引物如下：

5.根据权利要求4所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其重组产物进行克隆时，将所述重组产物转入感受态细胞dh5α中进行克隆。

6.根据权利要求5所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其遗传转化时，利用农杆菌eha105菌株介导的遗传转化方法 。

7.根据权利要求6所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其转化的水稻品种为籼粳杂交稻品种春优84。

8.根据权利要求7所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其单倍体鉴定步骤为：先利用indel标记进行初步鉴定，再将鉴定得到的单倍体用流式细胞术进一步鉴定。

9.根据权利要求8所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其单倍体鉴定步骤，依据cy84亲本籼稻c84和粳稻春江16a设计的12对indel分子标记，区分cy84杂合子和纯合子，如果是单倍体indel条带应为单条带，所述的12对indel分子标记分别为seq id no.9-32所示。

10.权利要求1-9任一所述的方法在水稻育种中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术和植物育种领域，涉及利用孤雌生殖基因诱导单倍体的方法，尤其涉及一种水稻单倍体诱导方法。本发明提供的水稻单倍体诱导方法，包括以下步骤：用拟南芥卵细胞特异表达基因AtEC1.2的启动子诱导山柳菊（Pilosellapiloselloides）孤雌生殖基因PpPAR在水稻卵细胞中异位表达，诱导水稻进行孤雌生殖，得到水稻单倍体。本发明方法通过将自然界存在的山柳菊孤雌生殖基因PpPAR导入水稻中，通过让其在卵细胞异位表达，成功让水稻也可以进行孤雌生殖，在不影响植株生长发育的前提下，而能够诱导单倍体产生，为水稻单倍体育种提供了新的解决方案。

技术研发人员：王克剑,熊杰,姬亚捷,黄勇,刘朝雷
受保护的技术使用者：三亚中国农业科学院国家南繁研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11