胚胎微流控动态培养皿及其培养方法

本发明涉及生物学装置，尤其是涉及一种胚胎微流控动态培养皿及其培养方法。

背景技术：

1、胚胎培养是现代生物技术的一大亮点，是指在实验室内人为的干预下，对胚胎进行培养。如何利用早期胚胎体外培养技术培养出一定数量、高质量、发育潜力优良以及抗冻性好的胚胎，特别是囊胚，已经成为胚胎培养的重大课题。早期胚胎体外培养体系主要是尽可能模拟母体输卵管的生理环境构建培养环境，虽然体外培养已经历经几十年发展，但还存在胚胎质量差、囊胚率低等问题。随着改良培养液配方和胚胎培养体系，同时静态培养体系逐渐发展为动态培养体系，体外胚胎培养技术已得到较大的提升。

2、常规培养系统是将胚胎单独在培养液中进行培养，而不添加其他细胞及其分泌因子的一种培养方法，分为微滴法和培养板法。前者是在塑料皿中制作30-100μl的微滴，上面覆盖石蜡油，将胚胎置于其中培养，一般用于数量较少的胚胎培养；后者是直接将胚胎置于含500-800μl培养液的四孔培养皿中培养，一般用于数量较多的胚胎培养。通常，胚胎培养3天后可移植母体或重新转移到新的培养液中继续培养，等到第五天移植母体。经过胚胎培养液的不断改进和培养条件的逐步完善，该方法是目前胚胎体外培养的主要方法。

3、现有生物培养装置如下:

4、公开号为cn102876573a的专利公开了一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法，其中公开一种哺乳动物胚胎体外培养器，通过设置在培养室内带磁片的膜片的震动，带动培养室内的培养液、矿物油运动，模拟胚胎在哺乳动物体内显微环境条件下生长发育，刺激胚胎，使胚胎处于动态的、微观的以及三维的生长环境。

5、公开号为cn202786260u的专利公开了一种哺乳动物胚胎摇摆培养器，把可调角度及速度的摇摆电机的动力传输轴与放置有胚胎培养皿的载物台连接，通过摇摆电机带动载物台、胚胎培养器一起摇摆，使胚胎处于动态的培养状态。

6、上述现有技术无法及时更新及控制流经胚胎细胞的培养液，使得无法排除分泌物，也无法为胚胎细胞提供更简单高效的培养环境。

7、公开号为cn104371919b的专利公开了用于细胞培养的微流控芯片、动态培养装置及方法，利用手动控制营养池和储液池中的液面差调节驱动溶液在微流控芯片中流动的速度，并通过细胞捕获单元固定细胞，从而实现胚胎细胞的分泌物易于扩散，细胞和营养物质、生长因子充分接触的功能。但是通过人工不断调节液面高度实现液体交换操作过程复杂且可操作性较差，且该器件未曾考虑对胚胎进行回收的过程，具有胚胎卡在细胞捕获器中无法回收的风险。

8、公开号为us6193647b1的专利公开了一种模拟胚胎生物旋转的微流体胚胎处理装置和方法，通过在微管道中设计了收缩结构以管道中卵细胞进行定位。但是会使卵细胞受到较大的流体剪切力作用而可能对其带来伤害，另外这种方法不适合对多个卵细胞进行同时定位。

9、公开号为wo2005/023124a2的专利公开了用于处理细胞、胚胎或卵细胞的装置，将一连串的微坑顺序排布在一条较窄的微管道下方，可以用微管道将卵细胞依次送入微坑进行定位，然后实现后续的体外受精。器件微管道宽度较窄难以实现快速换液过程，并且没有考虑将细胞周围多余的细胞碎去除的问题。

10、公开号为cn101947124b的专利公开了一种集成式微流控芯片装置及其使用方法，设置有一个以上用来定位卵细胞的微坑，通过培养液辅助将卵细胞沿微管道层的微管道运送到微坑阵列层的某一个微坑上方，使卵细胞由于重力而落入微坑实现定位，集成完成受精过程、快速换液过程、胚胎培养过程和胚胎回收过程。旨在实现单个卵子的整个体外受精过程，但是由于卵子、合子、囊胚等大小不一样，固定口径的微坑无法实现从卵子到囊胚全过程的适配，同时交换不同的液体（缓冲液、矿物油、液化精液等）由于惯性力和粘性力的不一样，容易在微通道内改变流体的运动特征从而引起流体层之间的混掺造成微环境的扰动影响胚胎正常发育。

11、公开号为cn211005419u的专利公开了一种胚胎自动换液培养皿，每个培养单元包括注液池，培养池与废液池，胚胎放置在培养池中的微孔中，通过外部气压和重力作用实现换液。废液流道与胚胎距离较近，容易在废液腔的负压作用下损坏卵裂球表面的透明带或者囊胚期的滋养层细胞，且加胚胎过程中需要人工去除培养微孔内的气泡，复杂程度和人工干扰增加。

12、综上现有技术中的培养皿具有以下技术问题：

13、（1）无法及时更新及控制流经胚胎细胞的培养液，无法排除分泌物，在废液腔的负压作用下损坏卵裂球表面的透明带或者囊胚期的滋养层细胞，细胞受到较大的流体剪切力作用而可能对其带来伤害。

14、（2）液体交换操作过程复杂且可操作性较差，交换不同的液体时在微通道内改变流体的运动特征从而引起流体层之间的混掺造成微环境的扰动影响胚胎正常发育。

15、（3）未考虑对胚胎进行回收的过程，具有胚胎卡住无法回收的风险，无法对多个细胞进行同时定位。

16、（4）加胚胎过程中需要人工去除培养微孔内的气泡，复杂程度和人工干扰增加。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种胚胎微流控动态培养皿及其培养方法，解决上述存在的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种胚胎微流控动态培养皿，包括至少一个微流控芯片，微流控芯片包括依次连接的进液单元、培养单元以及出液单元；培养单元包括动态培养池，动态培养池设置有至少一个胚胎培养室，胚胎培养室底部设置有胚胎培养孔，胚胎培养孔沿培养液流动方向依次设置有胚胎缓动区、液体变形区以及液体引流区，进液单元与胚胎缓动区相连接，出液单元与液体引流区相连接。

3、优选的，进液单元包括一个进液口，进液口连接有至少一个进液微流通道，每个进液微流通道与相对应的胚胎培养室相连接，进液微流通道的采用直线结构或蛇形结构使得所有进液微流通道从进液口到相对应的胚胎培养室的行程相同。

4、优选的，出液单元包括至少一个出液口，出液口通过至少一个出液微流通道与胚胎培养室相连接，出液微流通道的采用直线结构或蛇形结构使得所有出液微流通道从出液口到相对应的胚胎培养室的行程相同。

5、优选的，进液微流通道与出液微流通道处于同一平面且水平设置，进液微流通道与出液微流通道的宽度为100-200μm，高度为50-100μm。

6、优选的，进液口连接端设置有脱气装置，脱气装置包括脱气管道，脱气管道一端设置有脱气膜并与进液口连接端相连接，脱气管道上设置有用于提供负压的脱气真空泵，进液口连接端连接有用于控制进液参数的液体控制装置。

7、优选的，每个出液微流通道上均设置有用于取样、观察和检测的代谢物检测窗口；

8、或出液口连接有检测装置，检测装置包括代谢物检测芯片，代谢物检测芯片的检测进液口与出液口通过连接管道相连接，代谢物检测芯片上设置有至少一个检测微流通道，每个检测微流通道均连接有排液口，检测微流通道上设置有代谢物检测窗口。

9、优选的，至少一个胚胎培养室呈空间矩阵排列，胚胎培养孔上方依次设置有培养液储存层和盖油层，胚胎培养室深度为4-8mm，培养液储存层和盖油层的厚度均为2-4mm，盖油层相对胚胎培养室的内壁进行疏水处理，进液单元、胚胎培养孔、培养液储存层相对胚胎培养室的内壁以及出液单元均进行亲水处理，微流控芯片上设置有患者信息识别区，每个胚胎培养室均设置有数字标识。

10、优选的，胚胎缓动区底部宽度为0.25-0.35mm，高度为0.35-0.4mm，胚胎缓动区的进液侧与进液微流通道呈70-85°的锐角，胚胎缓动区的出液侧与液体变形区呈30-60°的锐角；

11、液体变形区低于进液微流通道且高于胚胎缓动区0.1-0.3mm；

12、液体引流区为斜坡结构，液体引流区的坡度为10-90°。

13、优选的，还包括设置在微流控芯片上的培养皿盖。

14、基于上述一种胚胎微流控动态培养皿的培养方法，具体步骤如下：

15、步骤s1：预热胚胎微流控动态培养皿并填充培养液和盖油层；

16、步骤s2：将胚胎逐一放置在胚胎培养室的胚胎培养孔中的胚胎缓动区；

17、步骤s3：进液口连接端连接液体控制装置和脱气装置，并放置于培养箱内，并开启成像系统采集胚胎图像；

18、步骤s4：进行设定参数下的卵裂期培养液的填充；

19、步骤s5：培养到设定的换液时间后，出液口接入负压设备，含有代谢物的胚胎培养液通过出液微流通道和出液口排出至废池仓自动回废液，排液时盖油层始终高于培养液液面的高度，盖油层停留在上层不发生混掺；

20、步骤s5：当胚胎发育到d3阶段，在预设的流速下填充囊胚期培养液，使得卵裂期培养液和囊胚期培养液逐步扩散；

21、步骤s6：当胚胎发育到d5阶段时，查看各个胚胎的发育状况，取出合格胚胎。

22、因此，本发明采用上述一种胚胎微流控动态培养皿及其培养方法，具有以下有益效果：

23、（1）通过进液口、进液微流通道、出液微流通道以及出液口配合液体控制装置及时更新及控制流经胚胎细胞的培养液，液体交换操作过程简单，只需人工加培养液盖油和加胚后，全程系统自动完成，可操作性较佳。培养液交换时油盖层始终高于培养液液面，在培养液流动时只带走培养液，油盖层始终停留在上层，不发生混掺，微环境稳定，减少培养液的扰动对胚胎发育的影响。

24、（2）通过胚胎培养孔的设计可以将胚胎分泌物彻底清除干净，且减少流体剪切力作用带来的伤害，胚胎回收过程简单，与常规操作无差，不改变医师的操作习惯，胚胎培养孔的尺寸设计保证了胚胎不会倍卡死在微孔中，且不会有胚胎损伤的风险。出液微流通道距离胚胎缓动区域设置有液体变形区，在出液口的负压作用下不会损坏卵裂球表面的透明带或者囊胚期的滋养层细胞。

25、（3）进液微流通道、出液微流通道以及胚胎培养孔设置有多个，且具有数字标识，可实现对多个细胞进行同时定位。

26、（4）设置有脱气装置，可自动过滤空气柱，无需人工去除培养微孔内的气泡，减少人工干扰。

27、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。