一种抗MSH2重组兔单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于免疫化学，尤其涉及一种抗msh2重组兔单克隆抗体及其应用，特别是在免疫组织化学检测方面的应用。

背景技术：

1、错配修复系统（mismatch repair，mmr）是重要的dna修复机制，是识别和修复在dna复制或重组过程中，可能产生碱基的错误插入、缺失和错配以及修复某些形式的dna损伤的系统，防止基因突变以维持基因组稳定性。该系统由一系列特定的dna错配修复酶组成。mmr基因胚系检测是林奇综合征（lynch syndrome）诊断的“金标准”。lynch综合征的分子病因包括mmr基因家族中的mlh1、msh2、msh6或pms2基因上的杂合性致病突变，以及epcam基因缺失突变（该突变导致msh2启动子高度甲基化，引起msh2基因沉默）。由于mmr基因功能性失活，lynch综合征患者常常表现出msi-h和dmmr，因此msi检测和mmr蛋白ihc检测均可以作为初筛手段。

2、在免疫组化中，错配修复蛋白一般包括msh2、msh6、mlh1、pms2四项，一般联合应用于遗传性非息肉性肠癌（hnpcc）和伴有msi的肿瘤的筛查。其中msh2是一种分子量大小约为104kd的错配修复蛋白。mlh2可以与msh6形成异二聚体，msh2/msh6异二聚体负责通过构象变化与初始dna错配碱基结合，具有识别单个碱基的错配突变、短缺失、或插入突变等碱基错配的功能。该基因的突变会导致细胞错配修复功能缺陷，使微卫星不稳定（msi），从而导致肿瘤易感。

3、免疫组化（ihc）方法通过显微镜观察是否在细胞内正常表达，来判断mmr是否存在缺陷。但现有的抗msh2抗体灵敏度和特异性还有待提高，在ihc染色中评估较困难，影响检测区分癌症的准确性。目前市面上可见的elisa试剂盒检测灵敏度低、阳性信号弱，在ihc染色不利于识别，因此筛选一株高灵敏度、强特异性的抗msh2抗体，对识别和检测细胞上msh2蛋白的表达具有非常重要的作用。

技术实现思路

1、（一）要解决的技术问题

2、本发明提出一种抗msh2重组兔单克隆抗体及其应用，其目的在于解决现有抗msh2重组兔单克隆抗体阳性信号弱，在ihc染色不利于识别的问题。

3、（二）技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

5、第一方面，本发明提供一种抗msh2重组兔单克隆抗体，所述抗msh2重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，

6、所述重链可变区为：如seq id no.4所示的氨基酸序列；或seq id no.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽；

7、所述轻链可变区为：如seq id no.5所示的氨基酸序列；或seq id no.5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

8、第二方面，本发明提供编码所述的抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸。

9、优选地，所述核苷酸包括如seq id no.2所示的dna序列，用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的重链可变区；以及如seq id no.3所示的dna序列用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的轻链可变区。

10、第三方面，本发明涉及一种核酸分子，其包括用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸。

11、第四方面，本发明保护一种含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达载体或重组质粒。

12、第五方面，本发明提供一种抗msh2重组兔单克隆抗体的制备方法，采用上述表达载体转染细胞，培养转染后的细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗msh2重组兔单克隆抗体。

13、更优选地，所述制备方法包括如下步骤：

14、（1）免疫兔子：先对msh2蛋白分子序列进行分析，依据msh2的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择和使用合适的多肽序列作为免疫原，经由klh或ova偶联后作为免疫原，免疫兔子；所述多肽为seq id no.1所示的人工合成多肽；

15、（2）制备杂交瘤细胞系：经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞系，从杂交瘤细胞系中分离出总rna；

16、（3）获得抗体序列：利用特异性的引物，通过pcr扩增技术获得抗体重链可变区的核苷酸序列seq id no.2和抗体轻链可变区的核苷酸序列seq id no.3；

17、（4）抗体表达和纯化：将所述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染方法瞬时转染培养的细胞，培养后收集上清，使用protein a纯化上清液，得到纯度＞95％的抗体。

18、第六方面，所述的抗msh2重组兔单克隆抗体、核苷酸、核酸分子、表达载体或重组质粒在制备msh2蛋白分子检测装置中的应用。所述检测装置包括但不限于试剂盒、抗体芯片等。

19、第七方面，本发明还提供一种msh2检测试剂盒，其包括上述的抗msh2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。

20、优选地，所述msh2检测试剂盒还包括底物显色液、封闭液或修复液中的至少一种。

21、进一步优选的包括：抗msh2重组兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗（hrp酶标二抗）、edta修复液、过氧化氢酶封闭液、3，3-二氨基苯联胺浓缩液（dab浓缩液）、3，3-二氨基苯联胺缓冲液（dab缓冲液）、苏木素和返蓝液。

22、在进行免疫组织化检测时，检测步骤包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、3，3-二氨基苯联胺显色（dab显色）、复染、脱水、封片和镜检等。

23、（三）有益效果

24、本发明提供的抗msh2重组兔单克隆抗体，本发明还涉及编码该抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组质粒或表达载体、制备方法及抗msh2重组兔单克隆抗体在msh2蛋白检测方法或装置中的应用等。抗msh2重组兔单克隆抗体与msh2蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度，能够特异性地识别和检测细胞上msh2蛋白的表达，在检测msh2蛋白时呈阳性高表达，因此该抗体可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(westernblotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得准确的评估和检测结果。本发明的644g5a4克隆的msh2重组兔单克隆抗体由于其特异性好，阳性信号强等特点，在ihc染色中评分更容易，对于检测区分癌症更准确。可应用于免疫组织化学、间接elisa、免疫印记、抗体芯片制备等检测与筛查领域，有利于获得更准确的检测和评估结果，并降低检测成本和背景信号的干扰。

技术特征：

1.一种抗msh2重组兔单克隆抗体，其特征在于，所述抗msh2重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，

2.编码权利要求1所述的抗msh2重组兔单克隆抗体的核苷酸。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸包括：如seq id no.2所示的dna序列，以用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的重链可变区，以及如seq id no.3所示的dna序列，以用于编码所述抗msh2重组兔单克隆抗体的轻链可变区。

4.一种核酸分子，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的核苷酸。

5.含有权利要求4所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达载体或重组质粒。

6.一种抗msh2重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其采用权利要求5所述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗msh2重组兔单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.权利要求1所述的抗msh2重组兔单克隆抗体、权利要求2或3所述核苷酸、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的生物材料在制备msh2检测装置中的应用。

9.一种msh2检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1的抗msh2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。

10.根据权利要求9所述的msh2检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括底物显色液、封闭液或修复液中的至少一种。

技术总结
本发明属于免疫化学技术领域，涉及一种抗MSH2重组兔单克隆抗体及其应用，所述抗MSH2重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为：如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽；所述轻链可变区为：如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。本发明提供的抗MSH2重组兔单克隆抗体，与MSH2蛋白具有高亲和力，可高特异性和高灵敏度地识别和检测细胞上MSH2蛋白的表达。

技术研发人员：肖目张,徐志杰,何青春,刘杨,张东旭
受保护的技术使用者：苏州百道医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17