一种与不结球白菜叶片深紫色相关的InDel分子标记及其应用

本发明属于分子标记辅助育种，具体涉及一种与不结球白菜叶片深紫色相关indel分子标记检测引物组及其用途。

背景技术：

1、不结球白菜(brassica campestris ssp.chinensis makino)又称小白菜，是十字花科芸薹种亚种之一，因其适应力强且营养价值高，近年来大面积引种生产，已成为全球的主要供应蔬菜。紫色蔬菜因富含花青素而深受消费者喜爱。花青素(anthocyanin)是类黄酮合成途径的一类水溶性色素，具有保护人类免受糖基化和炎症引起的各种慢性疾病的侵害的功能。随着分子生物学的发展和白菜基因组测序的完成，与白菜叶色相关的基因相继被定位和克隆，紫色的表现程度不同，基因也位于不同染色体，表明白菜中叶紫色调控是复杂的。

2、indel多态性分子标记是基于插入/缺失(insertion-deletion，indel)位点两侧的序列设计特异引物进行pcr扩增的标记，具有准确性高、易于分型、检测简便的优点。其在蔬菜育种中应用十分广泛。开展不结球白菜叶片紫色基因的定位，开发与紫叶性状基因的indel分子标记对紫色基因克隆与遗传分子改良育种具有一定的指导意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中的上述不足，利用bsa-seq将紫叶基因定位于a03染色体，开发与该性状紧密联系的分子标记并验证标记的可靠性，目的是提供一种与不结球白菜叶片紫色相关indel分子标记检测引物组，同时提供该分子标记的应用。本发明通过构建紫色不结球白菜和绿色不结球白菜杂交群体，并利用f2:4代分离群体，对其进行表型鉴定，遗传模式分析，混池测序，图位克隆，获得了可用于区分紫色和绿色品种的indel标记。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一组不结球白菜紫色indel分子标记检测引物组，包括检测indel分子标记位点的特异性引物，特异性引物具体序列如下：

4、z364-forward primer：5’-gtgctccataacttttcatt-3’(seq id no.1)；

5、z364-reverse primier：5’-ccctgacaacgtttaaaatc-3’(seq id no.2)。

6、所述正向引物名称为z364 forward primer；所述反向引物名称为z364 reverseprimier。

7、使用标记z364，其中若分离条带中只含有139bp的dna片段，说明该材料的叶片表现为紫色，记为a，其序列为seq id no.3，具体序列如下：

8、gtgctccataacttttcattttttctctggaagctggaagtctcttagttttcaaata gttactctttttgtgcatagtaactattcgccttgttaaacattttaatacatatatacttga ttttaaacgttgtcaggg(seqid no.3)。

9、若z364分离条带中只含有130bp的dna片段，说明该材料的叶片表现为绿色，记为b，其序列为seq id no.4，具体序列如下：

10、gtgctccataacttttcattttttctctggaagctggaagtctcttagttttcaactt tttgtgcatagtaactattcgccttgttaaacattttaatacatatatacttgattttaaac gttgtcaggg(seq idno.4)。

11、若分离条带中含有139bp和130bp两个片段，则表明叶片表现为浅紫记为h。

12、一种与不结球白菜叶片深紫色相关的indel分子标记，包括上述的引物序列。

13、一种与不结球白菜叶片深紫色相关indel分子标记的检测方法，包括以下步骤：

14、(1)提取待鉴定植物材料的基因组dna

15、(2)以步骤1中提取的待测样品的dna为模板，利用权利要求1～3任意一项所述的indel分子标记、权利要求4～5所述的方法，对dna样品模板dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

16、(3)对pcr扩增产物进行12％聚丙酰胺凝胶电泳检测，若分离条带中只含有139bp的dna片段，说明该材料的叶片表现为紫色纯合，若只含有130bp的dna片段，说明该材料的叶片表现为绿色纯合，若含有139bp和130bp两个片段，则表明叶片表现为浅紫色杂合。

17、进一步地，步骤(2)中pcr扩增体系为：200ng/μldna模板1μl、10μms-63或z364引物上下游各0.5μ，2×santaqpcrmix5μl，ddh2o3μl。总反应体系为10μl。

18、进一步地，步骤(2)中pcr反应程序为94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、45s，35个循环；72℃、10min，冷却至12℃保存。

19、上述indel分子标记在不结球白菜紫色品种基因分型中的应用。

20、上述indel分子标记在不结球白菜紫色品种质资源鉴定、遗传多样性分析中的应用。

21、上述indel分子标记在筛选或鉴定不结球白菜紫色品种中的应用。

22、上述indel分子标记在培育不结球白菜紫色品种，或不结球白菜种质资源改良中的应用。

23、本发明的有益效果：

24、本发明通过构建紫色不结球白菜和绿色不结球白菜杂交群体，并利用f2:4代分离群体，对其进行表型鉴定、遗传模式分析、混池测序、图位克隆，开发了可用于区分紫色品种的indel分子标记，可以较为准确地区分出不结球白菜叶片紫色纯合、绿色纯合与浅紫色杂合个体，具有较强的可靠性和准确性。此外本发明提供的indel分子标记可用于在苗期对紫色不结球白菜进行快速鉴定和区分，效率高且操作简便，检测成本低，可加速不结球白菜叶色育种进程。

技术特征：

1.一组用于鉴定或辅助鉴定不结球白菜叶片颜色的indel分子标记，其特征在于，所述的indel标记为插入/缺失序列，通过引物序列如所示的特异性引物所扩增得到。

2.根据权利要求书1所述的indel分子标记，其特征在于，indel标记z364所述产物序列如seq id no.3-4所示。

3.用于检测权利要求1或2所述的indel分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述的引物组序列为：

4.一种检测不结球白菜紫色叶片分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过pcr产物来鉴定不结球白菜叶色性状的过程为：若pcr产物中含有一条139bp的dna片段，其序列为seq id no.3，则待鉴定不结球白菜为紫色叶片性状；若pcr产物中含有一条130bp的dna片段，其序列为seq id no.4，则待鉴定不结球白菜为绿色叶片性状；若pcr产物中含有139bp和130bp两条dna片段，且则待鉴定不结球白菜为浅紫色叶片性状，为杂合性状。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应程序为：

7.权利要求1或2所述的indel分子标记、权利要求4或5所述的方法在不结球白菜遗传育种中的应用。

8.权利要求1或2所述的indel分子标记、权利要求4或5所述的方法在不结球白菜紫色品种质资源鉴定、遗传多样性分析中的应用。

9.权利要求1或2所述的indel分子标记、权利要求4或5所述的方法在筛选或鉴定不结球白菜紫色品种中的应用。

10.权利要求1或2所述的indel分子标记、权利要求4或5所述的方法在培育不结球白菜紫色品种，或不结球白菜种质资源改良中的应用。

技术总结
本发明公开了一种与不结球白菜叶片深紫色性状相关InDel分子标记及其用途，涉及分子标记辅助育种技术领域。本发明所述Indel分子标记的多态性为插入/缺失序列，通过序列如SEQ ID NO.1～2所示的特异性引物扩增得到。本发明通过构建紫色不结球白菜和绿色不结球白菜杂交群体，并利用F<subgt;2:4</subgt;代分离群体，对其进行表型鉴定，遗传模式分析，混池测序，获得了可用于区分紫色与绿色叶色的InDel标记，该分子标记可用于鉴定紫叶和绿叶不结球白菜，具有较高的准确性，可作为紫色不结球白菜分子标记辅助育种选择工具。在实际生产应用中具有重要意义。

技术研发人员：惠麦侠,周晓青,陈欣宇,司佳,崔佳月
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24