玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用

本发明涉及生物，具体第，涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用。

背景技术：

1、霉菌毒素是霉菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及烟曲霉毒素等。谷物等原料在田间会被霉菌污染，在运输、加工、储存过程中如果环境温度、湿度适合，霉菌会继续生长，毒素含量也会相继增加。据联合国粮农组织估计，全世界每年有25％的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2％不能食用；加之因毒素污染导致动物中毒引起的疾病和死亡，给粮食工业和畜牧业造成巨大的经济损失。

2、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)又称f-2毒素，由stob等人于受赤霉病污染的玉米中分离得到，主要由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌和克地镰刀菌产生；镰刀菌既营寄生生活、又营腐生生活，生态适应性强，分布广泛，玉米、小麦、大麦和燕麦等谷物发生霉变易感染镰刀菌而被zen污染。动物由于食用受zen污染的饲料吸收zen，zen具有类雌激素作用，在体内能与雌激素竞争结合相应受体，激活下游反应元件，引发雌激素受体二聚化，进而产生一系列的拟雌激素效应，造成动物体内雌激素水平紊乱，破坏动物尤其是母猪的生殖系统。主要表现为食欲下降、免疫抑制以及生长缓慢，持续中毒会使母畜产生繁殖障碍，引发不孕不育、流产和死胎现象。zen还具有很强的致癌性，可通过动物的摄入影响人类可食用的肉制品和奶制品，对人类的健康造成严重威胁。

3、为了避免zen通过饲料、食品原料等方式进入食物链，除了加大对于饲料、食品原料等的监管和检测力度，还可以通过一些方法降低或去除zen。降解zen及其衍生物的方法主要包括化学法、物理法和生物法；化学法主要是通过强酸强碱如臭氧、过氧化氢、碳酸钠等化学试剂与zen发生化学反应，将其转变成其他低毒甚至无毒物质；物理法主要是高温法、辐射法、高压法及吸附法等，然而，这些技术只是部分有效，不能完全去除zen，并且由于其高成本和低效率而使工业应用受到阻碍。化学和物理处理还会破坏谷物和饲料的营养成分，引入二次污染。相比之下，生物法具有环保，高效，成本低等优点，更重要的是不会对食品或饲料原料造成二次污染。因此，这种方法在食品和饲料工业中显示出巨大的前景。

4、生物法主要包括微生物吸附和酶降解法；对于微生物吸附法，研究发现酵母菌和乳酸菌等真菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，它们通过糖苷键连接，在细胞壁表面形成网状结构，对于zen等真菌毒素具有显著的吸附作用。生物酶降解法主要是微生物代谢产生的酶(内酯水解酶、蛋白酶和过氧化物酶等)能通过水解或氧化等方式破坏zen的结构使其转化成低毒或无毒物质。

5、但是已有的玉米赤霉烯酮降解酶存在热稳定性弱、耐酸性能差等问题，难以满足工业应用的需求；这一问题如能够有效解决，将会对玉米赤霉烯酮的降低与去除具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用，该玉米赤霉烯酮降解酶突变体不仅具有高效的玉米赤霉烯酮降解活性，而且热稳定性强、耐酸性好。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体，该突变体与氨基酸序列为seq id no：1所示的蛋白相比，包含r位点的突变；所述r位点选自第67位、第72位、第73位和第176位中的至少一个。

3、优选地，所述突变体与氨基酸序列为seq id no：1所示的蛋白相比，包含第67位的谷氨酰胺突变为缬氨酸、第72位的赖氨酸突变为丙氨酸、第73位的精氨酸突变为天冬氨酸和第176位的缬氨酸突变为苯丙氨酸中的至少一者。

4、优选地，该突变体的氨基酸序列如seq id no：2所示。

5、本发明第二方面提供一种编码玉米赤霉烯酮降解酶突变体的基因，该基因具有编码上述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体的核苷酸序列。

6、优选地，所述基因具有编码seq id no：2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

7、优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。

8、本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的基因。

9、优选地，所述重组载体的表达载体为pet系列质粒。

10、本发明第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的基因或者上述的重组载体。

11、优选地，所述重组菌株的宿主菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。

12、优选地，所述重组菌株的宿主菌株为大肠杆菌bl21(de3)。

13、本发明第五方面提供上述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体、上述的基因、上述的重组载体和上述的重组菌株中的至少一者在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

14、本发明第六方面提供一种降解玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括以下步骤：将上述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体、上述的基因、上述的重组载体和上述的重组菌株中的至少一者与玉米赤霉烯酮接触。

15、优选地，所述接触的条件包括：温度为45-50℃，ph为4-6。

16、通过上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶突变体具有较强的热稳定性和结构稳定性，在37℃下保持8h后酶活保持60％以上；多点突变体的最适温度上升到45-50℃，与野生型酶相比提高了10℃以上，且耐酸性能显著提高；在最适催化条件下，本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶突变体催化降解玉米赤霉烯酮的相对酶活无明显下降，这一发现对于工业化降解玉米赤霉烯酮具有重要的研究价值。

技术特征：

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体，其特征在于，该突变体与氨基酸序列为seq idno：1所示的蛋白相比，包含r位点的突变；所述r位点选自第67位、第72位、第73位和第176位中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体，其特征在于，所述突变体与氨基酸序列为seq id no：1所示的蛋白相比，包含第67位的谷氨酰胺突变为缬氨酸、第72位的赖氨酸突变为丙氨酸、第73位的精氨酸突变为天冬氨酸和第176位的缬氨酸突变为苯丙氨酸中的至少一者；

3.一种编码玉米赤霉烯酮降解酶突变体的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所示的基因，其特征在于，所述基因具有编码seq id no：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3或4所述的基因。

6.根据权利要求5所示的重组载体，其特征在于，所述重组载体的表达载体为pet系列质粒。

7.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求3或4所述的基因或者权利要求5或6所述的重组载体。

8.根据权利要求7所示的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的宿主菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌；

9.权利要求1或2所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体、权利要求3或4所述的基因、权利要求5或6所述的重组载体和权利要求7或8所述的重组菌株中的至少一者在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

10.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将权利要求1或2所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体、权利要求3或4所述的基因、权利要求5或6所述的重组载体和权利要求7或8所述的重组菌株中的至少一者与玉米赤霉烯酮接触；

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用。玉米赤霉烯酮降解酶突变体与氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白相比，包含R位点的突变；所述R位点选自第67位、第72位、第73位和第176位中的至少一个。降解玉米赤霉烯酮的方法包括以下步骤：将上述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体、上述的基因、上述的重组载体和上述的重组菌株中的至少一者与玉米赤霉烯酮接触。该玉米赤霉烯酮降解酶突变体不仅具有高效的玉米赤霉烯酮降解活性，而且热稳定性强、耐酸性好。

技术研发人员：徐晴,薛锋,刘雪,许浩东
受保护的技术使用者：南京师范大学常州合成生物学产业研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24