一种恒温单管检测单碱基变异的方法及其检测试剂盒与流程

本发明属于恒温核酸检测，具体涉及一种恒温单管检测单碱基变异的方法及其检测试剂盒，尤其涉及一种偶联等温扩增和等温酶切反应的单管检测单碱基变异的方法。

背景技术：

1、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)分型、体细胞单碱基突变检测对疾病诊断和精准治疗具有重要意义，但其对检测方法要求高，需要能够识别单碱基差异靶标，主要采用基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)的taqman探针法。事实上，与依赖热循环的pcr扩增不同，恒温扩增反应具有对仪器温度变化要求低、扩增速度快等优势，特别适合试纸条、微流控等检测平台，更符合即时检测(point-of-caretesting，poct)的需求，有利于实现快速、便携、低成本的床旁检测。目前，恒温条件下稳定扩增的技术主要有环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)、滚环扩增(rolling circleamplification，rca)等。尽管恒温扩增技术能够在恒定温度下迅速扩增产生大量模板，但由于聚合酶没有5’→3’外切酶活性，无法直接加入taqman-mgb探针检测多重靶标或进行序列差异区分，故恒温扩增技术主要应用于单一靶标检测，通过染料法、指示剂法、浊度法等判断靶标有无。因此，实现恒温条件下对不同核酸靶标，特别是单碱基差异靶标的特异性检测是一大难题。

2、为了克服恒温扩增只能进行单个靶标检测的不足，有研究尝试引入其他酶反应，如连接酶、成簇规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)及crispr辅助蛋白(crispr-associated proteins，crispr/cas)组成的crispr/cas基因编辑系统等，但这类方法需要在不同管中进行反应，或需要开管处理扩增产物，操作步骤繁琐。也有研究为了实现单管恒温检测不同靶标，联合其他核酸内切酶反应，并对靶标检测探针进行了改进，即在常规荧光基团修饰基础上增加特殊修饰，如rna修饰探针、四氢呋喃残基修饰等，通过引入特殊修饰，让靶标检测反应与恒温扩增反应能够兼容在一管体系中，但这类方法信号报告基团修饰的报告探针不通用，且制作成本高，导致方法研发成本和检测试剂成本昂贵，并不适合大范围推广应用。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种单碱基分辨率高、灵敏度高、操作简便、探针通用性好、检测成本低的恒温单管检测单碱基变异的新方法，能够在闭管条件下识别具有单个碱基差异的核酸靶标。

2、本发明还要解决的技术问题是提供了一种单管检测碱基变异的试剂盒。

3、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种恒温单管检测单碱基变异的方法，所述方法为偶联等温扩增和等温酶切反应的方法，具体包括以下步骤：在单管中配制包括lamp扩增引物、带有标签序列1的野生型靶标的下游检测探针，带有标签序列2的突变型靶标的下游检测探针，匹配签序列1的信号报告探针1、匹配签序列2的信号报告探针2、聚合酶和核酸酶的反应体系，加入待检测样本后，在恒定温度下进行反应，通过生成的报告信号判断具体的检测靶标，所述的带有标签序列1野生型靶标的下游检测探针1和带有标签序列2的突变型靶标的下游检测探针2是针对靶标在扩增过程中大量形成的中间体区域特异性设计得到。

4、其中，所述聚合酶包括bst dna聚合酶、bsu dna聚合酶或phi29 dna聚合酶中的一种。

5、其中，所述核酸酶只有在检测探针与靶标序列杂交或标签序列与信号报告探针杂交后才进行切割反应，所述的核酸酶包括核酸内切酶、核酸外切酶或切刻内切酶中的一种。

6、其中，所述核酸酶为flap核酸内切酶，所述flap核酸内切酶能识别由一条上游检测探针、一条下游检测探针与靶标序列杂交形成三碱基重叠的核酸侵入结构，该三碱基重叠区域位于下游检测探针和靶标序列杂交结合处，同时上游检测探针的3’端碱基侵入结合处5’端一个碱基，该区域形成后能够被flap核酸内切酶识别切割。

7、其中，所述反应体系还包括kcl、mgso4、(nh4)2so4、tris-hcl和tween-20。

8、其中，所述待测样本包括核酸、细胞裂解物、血液、唾液或尿液中的一种或几种。

9、其中，所述恒定温度为同时兼容恒温扩增反应和酶切反应的温度，作为优选，所述恒定温度为60℃～65℃。

10、其中，所述待检测样本包括l858r野生型样本、l858r突变型样本中的一种或两种，所述lamp扩增引物包括f3、b3、fip、bip、lf和lb，所述检测探针包括上游检测探针，野生型-t碱基下游检测探针，突变型-g碱基下游检测探针，匹配flap1的fret-probe1、通用荧光信号报告探针1，通用荧光信号报告探针2，所述f3如seq id no.3所示，所述b3如seq id no.4所示，所述fip如seq id no.5所示，所述bip如seq id no.6所示，所述lf如seq id no.7所示，所述lb如如seq id no.8所示，所述上游检测探针如seq id no.9所示，所述野生型-t碱基下游检测探针如seq id no.10所示，所述突变型-g碱基下游检测探针如seq id no.11所示，所述通用荧光信号报告探针1如seq id no.12所示，所述通用荧光信号报告探针2如seqid no.13所示。

11、本
技术实现要素：
还包括一种单管检测碱基变异的试剂盒，所述试剂盒包括lamp扩增引物f3、b3、fip、bip、lf和lb、上游检测探针，野生型-t碱基下游检测探针，突变型-g碱基下游检测探针，匹配flap1的fret-probe1、通用荧光信号报告探针1，通用荧光信号报告探针2，所述f3如seq id no.3所示，所述b3如seq id no.4所示，所述fip如seq id no.5所示，所述bip如seq id no.6所示，所述lf如seq id no.7所示，所述lb如如seq id no.8所示，所述上游检测探针如seq id no.9所示，所述野生型-t碱基下游检测探针如seq id no.10所示，所述突变型-g碱基下游检测探针如seq id no.11所示，所述通用荧光信号报告探针1如seqid no.12所示，所述通用荧光信号报告探针2如seq id no.13所示。

12、其中，所述试剂盒还包括bst聚合酶、重组fen1酶、dntpmix、甜菜碱、kcl、mgso4、(nh4)2so4、tris-hcl，tween-20。

13、有益效果：与现有检测方法相比，本方法具有如下优点：本方法通过将恒温扩增与酶切反应结合，利用酶切反应的特异性，实现了单碱基的检测分辨率，其中与靶标结合的检测探针设计了标签序列，通过标签序列与信号报告探针的杂交进一步将识别到的靶标信息转换为信号报告探针输出的信号，达到了信号报告探针通用的目的，节约了检测方法的试剂成本。因此，与现有的恒温检测方法相比，本方法具有操作简便、检测灵敏度高、特异性好、信号报告探针通用等优势，能够实现单管对单碱基差异靶标的低成本恒温检测，可用于snp分型和突变检测。