一组草鱼C3.1基因SNP分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用

本发明涉及分子标记技术，具体而言，涉及一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在草鱼出血病抗性中的应用。

背景技术：

1、草鱼(ctenopharyngodon idella)隶属于鲤科、雅罗鱼亚科、草鱼属，是我国淡水养殖中重要的养殖鱼类之一，2022年年产量达590.4万吨，居淡水养殖产量首位，较2021年增幅2.6％，在我国淡水鱼类养殖产量中占比21.79％。近些年来我国草鱼养殖产量增长迅速，养殖规模逐渐扩大，养殖方式也逐渐增多。草鱼出血病属呼肠孤病毒科(reoviridae)水生呼肠孤病毒属成员(aquareovirus)，因此也称之为草鱼呼肠孤病毒(grass carpreovirus，gcrv)，是一种传染快、发病急、死亡率高的危害鱼类最严重的流行病，主要危害一、二龄鱼种，流行季节(6－9)月发病率高，死亡率高达80％以上。电镜观察结果显示，gcrv能在草鱼肠道、脾网状细胞、血管内皮细胞、肾等组织中进行复制，无外衣壳的未成熟gcrv粒子存在于肾脏组织，而成熟的gcrv粒子则主要分布于肠道内，在草鱼其他组织中没有观察到相应的病毒颗粒。目前草鱼出血病的防控大致可分为疫苗预防免疫、抗病毒药物防治和生态防控三类，以疫苗免疫为主。

2、补体系统(complement system)是由30多种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，在先天性免疫和适应性免疫中均起着重要的作用。种质资源是遗传育种的物质基础，经过多年的工作，为草鱼种质资源保护和遗传改良提供了坚实保障，其中分子遗传学、基因组学研究在其中占据重要地位。其中分子标记已经在畜禽和水产抗病育种中已经起到了非常重要的作用，且研究表明，某些基因的多态性与抗病性状是有关联的，如tlrs、mbl等，也越来越多的学者将防治草鱼出血病的目光投向了草鱼群体中的抗性群体，欲通过育种改良解决这一难题。陈松林团队通过对mhcⅱb基因的多态性研究，筛选出牙鲆抗病等位基因，并将其用于抗病品系的选育中，培育了具有抗病力强的“鲆优2号”；等筛选出了大西洋鲑中抗病性强和易感病的mhc基因型，选出了2个抗病基因型家系和1个易感家系；

3、在补体各成分中，c3的血清含量最高；在功能上，c3亦居于中心地位，它既是几条激活途径的交汇，又是c3b依赖性阳性反馈环路的基础；同时，c3裂解片段及其结合蛋白复杂而多样，在免疫防御、免疫调控以及免疫病理中发挥着重要作用。c3(186kda)裂解为c3b(177kda)和c3a(9kda)是补体激活级联的中心步骤，可通过三种不同的途径启动-经典途径，凝集素途径和替代途径。补体系统有多种成分介导三种激活途径，在清除外来病原体方面具有很高的效率，但其不适当和过度激活会引发宿主自身免疫性疾病。与具有单个c3的四足动物不同，所有硬骨鱼都具有多个c3，这使得硬骨鱼可以产生多个具有功能活性的c3a。从草鱼(ctenopharyngodon idella)基因组中鉴定出9个c3基因，命名为c3.1-c3.9。

4、基于c.idella的转录组分析，补体通路在草鱼感染gcrv过程中变化显著，c3基因为补体通路中关键基因，基于草鱼中具有多个c3拷贝数，本发明的研究目的为，对草鱼c3.1-c3.9进行进化及结构特征分析，判断多个c3拷贝基因中主效因子，并研究该基因snp位点研究其与草鱼出血病抗性关联，为开发草鱼抗gcrv分子育种提供基础依据。

技术实现思路

1、本发明首先提供了一组草鱼c3.1基因snp分子标记，所述分子标记包含snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9和snp10；

2、所述snp1位点为1号染色体上的第7065位核苷酸；

3、所述snp2位点为1号染色体上的第42128位核苷酸；

4、所述snp3位点为1号染色体上的第42188位核苷酸；

5、所述snp4位点为1号染色体上的第42452位核苷酸；

6、所述snp5位点为1号染色体上的第48268位核苷酸；

7、所述snp6位点为x号染色体上的第76714位核苷酸；

8、所述snp7位点为1号染色体上的第76773位核苷酸；

9、所述snp8位点为1号染色体上的第76945位核苷酸；

10、所述snp9位点为1号染色体上的第77153位核苷酸；

11、所述snp10位点为1号染色体上的第77252位核苷酸；

12、所述snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9和snp10位点在染色体上的位置是基于草鱼参考基因组序列比对确定的，草鱼参考基因组序列的版本号为hzgc01(gca_019924925.1)。

13、本发明还提供了上述分子标记作为检测靶标在开发产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

14、(a)筛查gcrv抗性群体；

15、(b)筛查gcrv易感群体

16、(c)评价鱼类患出血病抗性的风险；

17、(d)鱼类抗gcrv分子育种；

18、任选地，所述鱼类为草鱼。

19、本发明还提供了用于检测上述分子标记的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

20、(a)筛查gcrv抗性群体；

21、(b)筛查gcrv易感群体；

22、(c)评价鱼类患出血病抗性的风险；

23、(d)鱼类抗gcrv分子育种；

24、任选地，所述鱼类为草鱼。

25、优选地，所述物质为引物。

26、优选地，所述引物包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8。

27、本发明还提供了一种产品，包括上述分子标记的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

28、(a)筛查gcrv抗性群体；

29、(b)筛查gcrv易感群体；

30、(c)鉴定鱼类出血病抗性；

31、(d)鱼类抗gcrv分子育种；

32、任选地，所述鱼类为草鱼。

33、优选地，所述物质为引物。

34、优选地，所述引物包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8。

35、本发明还提供了一种鉴定草鱼出血病抗性的方法，其包括如下步骤：检测上述的snp，然后判断基因型。

36、优选地，所述方法用于非诊断目的。

37、本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：

38、本发明以草鱼(ctenopharyngodon idella)的c3.1。表达分析表明，c3.1是草鱼中的优势c3分子，它在c3主效表达组织肝脏中的表达在mrna水平上都显著高于其他c3分子。本发明对分组家系后代攻毒后进行qpcr，c3.1在肝和头肾中的相对表达量较高，随攻毒进程两次上升下降，其中在12h具有显著差异，子代抗性和易感群体c3.1的表达具有显著差异。测序扩增确定c3.1基因内含子上存在一些抗gcrv相关单核苷酸多态性位点，其中具有显著差异性位点有snp3(g.42188a/g)的aa基因型，snp7(g.76773c/t)的ct基因型，snp8(g.76945t/c)的ct基因型。本发明揭示了c3.1在草鱼免疫抗病方面的作用，为开展草鱼抗gcrv分子育种提供了相关有效标记，并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。