一种基于5’连接的单链DNA特异的高通量测序方法

本发明属于生物，具体涉及一种基于5’连接的单链dna特异的高通量测序方法。

背景技术：

1、高通量测序技术（high-throughput sequencing）是对传统sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变，一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，因此也称为下一代测序技术（next generation sequencing，ngs，二代测序技术）。高通量测序技术迅猛发展，解析并鉴定了许多人类和动植物正常和致病性状的基因，从全基因组的层面了解到前所未知的生物遗传和发育学问题。

2、许多研究表明，多种dna相关的生物学过程都会产生单链dna，最近发现人血浆中也有游离单链dna的存在。为了探索单链dna的生物学意义，开发出对其特异、灵敏且稳定的测序方法无疑是十分必要。目前已经报道的测序方法都无法特异区分样品中的单链dna与双链dna，从而无法特异性针对单链dna进行测序。

3、高通量测序技术的流程一般可分为四步，测序流程的第一步是dna文库制备，文库制备是在不同目的dna的两端引入测序接头，为后续步骤做准备的过程。文库制备决定了整个测序流程的走向，是各种测序方法有所差异的根源。为特异性针对单链dna进行测序，制备文库的方法仍有待改进。

技术实现思路

1、本发明旨在建立一套高度特异、稳定且灵敏的单链dna高通量测序技术。具体地，本发明提供了以下技术方案：

2、一方面，本发明提供了一种制备基于5’末端连接的单链dna测序文库的方法，所述方法包括以下对待测样本处理的步骤：

3、步骤1）使用不含外切酶活性的dna聚合酶补齐双链dna 5’末端；

4、步骤2）3’末端加尾；

5、步骤3）连接复性处理的5’茎环接头，所述5’茎环接头的结构是：突出末端-随机碱基区-第一茎区-环区-第二茎区，所述第一茎区与第二茎区通过复性形成双螺旋结构（形成双链）；

6、步骤4）对连接产物进行扩增。所述扩增的产物构成单链dna测序文库。

7、具体地，所述不含外切酶活性是指不含5’→3’外切酶活性和/或3’→5’外切酶活性。

8、优选地，所述不含外切酶活性的dna聚合酶的用量不受限制，在任意浓度下均可以充分补齐5’突出末端，具体例如0.25 -1.5 u/µl。

9、优选地，所述不含外切酶活性的dna聚合酶包括kf酶（klenow fragment-3'→5'exo-）。

10、具体地，所述kf酶是大肠杆菌dna聚合酶i的n端截短片段，不含5’→3’外切酶活性，也不含3’→5’外切酶活性。

11、优选地，步骤2）中具体包括去磷酸化处理、dna纯化后进行加尾的步骤。

12、优选地，所述去磷酸化处理是使用重组虾碱性磷酸酶shrimp alkalinephosphatase （rsap）实现的，可以去除体系中的dntp的影响。

13、优选地，所述dna纯化的方法是本领域所常规熟知的，例如具体实施例中使用酚氯仿异戊醇进行纯化。

14、优选地，所述加尾也即添加poly（da）尾，或者是添加poly（dt）尾、poly（dc）尾和poly（dg）尾。

15、优选地，所述加尾所使用的试剂可以是末端转移酶和datp，从而添加poly（da）尾。

16、优选地，所述末端转移酶是tdt。具体地，所述tdt的中文名称为末端脱氧核糖核酸转移酶，英文名称为terminal deoxynucleotidyl transferase，是一种非模板依赖的dna聚合酶，可以催化在寡核苷酸、单链或双链dna的3’羟基端加上dntp。

17、优选地，所述步骤2）的反应体系中datp/dna的摩尔配比可以根据体系中dna总量进行调整，例如大于100或100-5000，所述datp/dna的配比具体例如100、500、1000、5000，皆有良好的加尾效果。

18、优选地，所述5’茎环接头的5’末端是羟基。

19、优选地，所述5’茎环接头的5’末端与3’末端均为羟基，且不含修饰。

20、优选地，所述第一茎区与第二茎区互补配对，通过不同碱基的对应关系互相以氢键相连形成茎区，通过复性形成双螺旋结构，从而使5’茎环接头形成茎环结构。

21、优选地，所述互补配对包括至少75%、80%、85%、90%、95%或完全的互补。

22、优选地，所述随机碱基区的长度为1-12nt，

23、优选地，所述随机碱基区的长度为6nt。

24、优选地，所述突出末端的长度为0-20nt，具体包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20nt；更优选为12nt。

25、优选地，所述第一茎区或第二茎区的长度为8-25nt，具体包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25nt；更优选为11nt。

26、优选地，所述第一茎区与第二茎区的长度可以相同或不同。

27、优选地，所述环区的长度为0-50nt，具体包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50nt；更优选为38nt。

28、同时，所述环区中还可以设置分子标签，例如n10。

29、优选地，所述5’茎环接头具有seq id no.1所示序列。

30、优选地，所述5’茎环接头/dna的摩尔配比大于12.5:1，更优选地大于50:1，最优选为50:1或大于50:1。其中，所述dna即为步骤2）处理后得到的dna。

31、优选地，所述步骤3）中还包括对dna 5’末端进行磷酸化处理从而提高连接效果的步骤。具体可以使用t4多聚核苷酸激酶t4 polynucleotide kinase。优选地，磷酸化处理后还进行纯化处理。

32、优选地，所述5’茎环接头连接是通过t4 dna连接酶实现的。

33、优选地，所述步骤3）所述复性指变性dna在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的过程。在dna热变性后，将温度缓慢降低而使dna逐渐冷却，并维持在低于tm值的一定范围内，变性后的单链dna即可恢复双螺旋结构，所述复性也称退火。

34、优选地，所述步骤4）中扩增前，还包括纯化单链dna连接产物的步骤。

35、优选地，当加尾是添加poly（da）尾时可以使用oligo d（t）25磁珠进行纯化。

36、优选地，所述步骤4）中扩增中可以采用包含标签序列（index）的引物。通过使用包含标签序列的引物对连接产物进行扩增，可以区分测序中不同的样品来源的数据，识别样品来源。

37、具体地，所述“标签序列”可以引入到步骤3）连接产物的5’端，也可以引入到步骤3）连接产物的3’端。所述标签序列的设计方法是本领域技术人员所常规熟知的，设计包含标签序列（index）的引物也是本领域技术人员所常规熟知的。

38、本发明所述“扩增”可分为变温扩增和恒温扩增两大类。变温扩增主要包括经典的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称pcr）和连接酶链式反应（ligasechain reaction，简称lcr），而恒温扩增包括链置换扩增（strand displacementamplification，简称sda）、滚环扩增（rolling circle amplification，简称rca）、环介导扩增（loop mediated amplification，简称lamp）、依赖解旋酶恒温扩增（helicase-dependent isothermal dna amplification，简称hda）、依赖核酸序列的扩增（nucleicacid sequence based amplification，简称nasba）、转录依赖的扩增系统（transcription-based amplification system，简称tas）。具体实施例中以pcr为例进行建库。

39、另一方面，本发明提供了一种单链dna高通量测序的方法，所述方法包括根据前述方法制备文库，并对所述测序文库进行测序的步骤。

40、优选地，所述测序可以通过包括illumina novaseq，hiseq x ten， illuminahiseq， illumina miseq、pacbio sequel、10× genomics及mgiseq-2000在内的高通量测序平台进行。

41、另一方面，本发明提供了一种制备基于5’末端连接的单链dna测序文库的装置，所述装置包括：5’突出末端的补齐单元、3’末端加尾单元、5’茎环接头的连接单元和扩增单元。

42、优选地，所述5’突出末端的补齐单元，用于使用不含外切酶活性的dna聚合酶补齐dsdna5’末端。

43、优选地，所述3’末端加尾单元，用于向3’末端加尾，优选加poly（da）。

44、优选地，所述5’茎环接头的连接单元，用于连接5’茎环接头，所述5’茎环接头的结构是：突出末端-随机碱基区-第一茎区-环区-第二茎区，所述第一茎区与第二茎区通过复性形成双螺旋结构。

45、优选地，所述随机碱基区的长度为6nt，所述突出末端的长度为12nt，所述第一茎区或第二茎区的长度为11nt，所述环区的长度为38nt。

46、在本发明中，所使用的术语“dna”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的dna。本领域的技术人员可以理解，基因组dna的来源不受特别限制，可以从任何可能的途径获得，可以是通过市售直接获得，也可以是从其他实验室直接获取，还可以是直接从样本中提取的。根据本发明实施例，所述单链dna分子可以通过对rna进行逆转录而获得的。根据本发明一个实施例，所述单链dna分子可以是通过对rna进行逆转录而获得的cdna分子。根据本发明实施例，所述单链dna分子是可以通过对双链dna样本进行变性而获得的。根据本发明一个具体实施例，所述单链dna分子可以是通过对双链dna样本进行热变性而获得的。本发明所述单链dna的量不受特别限制，本发明所述单链dna分子的长度不受特别限制，优选大于20nt的单链dna，优选地20-80、80-100 nt的单链dna，具体包括20、40、79、80nt。

47、可选地，所述单链dna分子可以是通过对rna进行逆转录而获得的；可选地，所述单链dna分子可以是通过对rna进行逆转录而获得的cdna分子；可选地，所述单链dna分子可以是由目标待测样本中提取而获得的。优选地，所述待测样本包括取自于动物（尤其是人）的外周血、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液等；所述待测样本也可以取自细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物等。所述待测样本中含有单链dna分子，也可以含有其他非目标核酸。所述待测样本中含有至少1 fmol的单链dna分子。