一种新型果蝇肠癌模型的构建方法

本发明涉及生物遗传学，具体涉及一种新型果蝇肠癌模型的构建方法。

背景技术：

1、果蝇是一种常用的模式生物，广泛应用于生物学、遗传学、医学等领域的研究。由于其基因组较为简单，繁殖速度快，生命周期短，易饲养等特点，是一种强大的遗传学模式生物。广泛运用于人类重大疾病研究，如神经退行性疾病、肿瘤等遗传筛选与分析。

2、结直肠癌，又称大肠癌，包括结肠癌和直肠癌，是消化道最常见的恶性肿瘤，在我国被列为第2位最常见的恶性肿瘤。近年来发病率越来越高，且呈年轻化趋势。大多数结直肠癌是由传统的腺瘤-癌途径导致的，起初是一个异常的隐窝，然后演变成良性腺瘤性息肉，最终导致腺癌。70％-80％的结直肠癌存在体细胞apc(adenomatous polyposis coli)基因突变，apc基因的失活是肠道肿瘤癌变的重要起始事件。大量研究表明，apc丢失后wnt信号通路的异常激活是结肠腺瘤形成的主要原因之一。

3、由于果蝇肠道和哺乳动物肠道在遗传调控、细胞组成等方面具有高度的相似性，果蝇成年肠道已经成为研究肠道稳态、再生和细胞异常增殖的理想模型。与哺乳动物类似，apc的缺失会导致果蝇肠道干细胞形成腺瘤。果蝇中有两个apc基因，apc1和apc2。有研究表明，只有基因apc1和apc2同时突变的情况下，才会导致果蝇肠上皮细胞增生。已有的果蝇肿瘤模型大多数运用marcm技术，通过使用marcm技术在果蝇中诱导特定组织中目的基因的表达，实现在特定组织中产生gfp标记且具有与人类肿瘤相似特征的肿瘤细胞。但是该技术复杂，很大程度上限制了apc突变导致的修饰基因大规模筛选与药物小分子大规模式筛选。因此迫切需要构建一种同时可抑制apc1和apc2的果蝇遗传模型，并且可以用于后续的大规模遗传筛选与药物小分子筛选。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型果蝇肠癌模型的构建方法。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种新型果蝇肠癌模型的构建方法，包含如下方法步骤：

4、(1)针对果蝇apc1、apc2基因，分别设计3个shrna序列，将选取的6个shrna序列组成一个发卡簇，通过人工合成生成如seq id no.1所示的序列；

5、(2)将seq id no.1所示的序列连接到puast-attb载体上，获得重组表达载体puast-attb-apc1/apc2rnai；

6、(3)将步骤2制备的重组表达载体注射到果蝇新产出的去除卵壳的受精卵的尾部，将注射完成后的卵放在25℃的湿盒中培养；

7、(4)受精卵孵化成的幼虫待其羽化成成虫后与野生型果蝇杂交，挑取子代眼睛颜色为红色的果蝇即为带有uas-apc1/apc2rnai转基因果蝇；

8、(5)所得的转基因果蝇和双平衡子果蝇sp/cyo；tm3/tm6b杂交一代后自交，筛选得到可稳定遗传的uas-apc1/apc2rnai果蝇；

9、(6)将uas-apc1/apc2rnai转基因果蝇与基因型为byn-gal4，uas-mitorfp果蝇杂交，筛选得到同时表达apc1和apc2干扰序列的肠癌模型果蝇。

10、具体的，步骤(1)中，所述果蝇apc1、apc2基因的ncbi id为nm_057804.3、nm_001347815.1。

11、具体的，步骤(2)中，将seq id no.1所示的序列通过kpni和xhoi酶切位点连接到puast-attb载体上。

12、具体的，步骤(3)中，所述果蝇为y[1]m{rfp[3xp3.pb]gfp[e.3xp3]＝vas-int.dm}zh-2a w[*]；m{3xp3-rfp.attp}zh-86fb。

13、具体的，步骤(4)中，所述野生型果蝇为w1118。

14、具体的，步骤(6)中，所述肠癌模型果蝇的基因型为byn-gal4,uas-mitorfp,uas-apc1/apc2rnai。

15、本发明的有益效果在于：本发明基因合成获得了果蝇apc1、apc2基因的shrna序列，利用显微注射技术和果蝇杂交技术，构建了一种新型转基因果蝇的肠癌模型，为更快更方便地筛选肠道癌症相关药物提供材料与思路，具有很好的应用前景。

16、本发明具有操作简单，可稳定遗传，重复性强等优点，该新型果蝇肠癌模型可用于研究引起肠道肿瘤的机制探索，也可以用于筛选对治疗肠道癌症有针对性的药物，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种新型果蝇肠癌模型的构建方法，其特征在于，包含如下方法步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述果蝇apc1、apc2基因的ncbi id分别为nm_057804.3、nm_001347815.1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将seq id no.1所示的序列通过kpni和xhoi酶切位点连接到puast-attb载体上。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述果蝇为y[1]m{rfp[3xp3.pb]gfp[e.3xp3]＝vas-int.dm}zh-2a w[*]；m{3xp3-rfp.attp}zh-86fb。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述野生型果蝇为w1118。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述肠癌模型果蝇的基因型为byn-gal4,uas-mitorfp,uas-apc1/apc2rnai。

技术总结
本发明公开了一种新型果蝇肠癌模型的构建方法，通过基因合成获得了果蝇APC1、APC2基因的shRNA序列，将利用显微注射技术和果蝇杂交技术，构建了一种新型转基因果蝇的肠癌模型，为更快更方便地筛选肠道癌症相关药物提供材料与思路，具有很好的应用前景，本发明具有操作简单，可稳定遗传，重复性强等优点，该新型果蝇肠癌模型可用于研究引起肠道肿瘤的机制探索，也可以用于筛选对治疗肠道癌症有针对性的药物，具有良好的应用前景。

技术研发人员：王虹,徐慧珍,黄增益,张婧雯,任肃霞,刘德一,程志,彭彦,程勇
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10