基于LAMP检测水稻白叶枯病病原菌的引物组及试剂盒的制作方法

本发明属于植物病原微生物检测，具体涉及基于lamp检测水稻白叶枯病病原菌的引物组及试剂盒。

背景技术：

1、水稻（oryza sativa l.）是世界上最重要的作物之一，同时也是一半以上人口的主食(fahad et al., 2014)。据2019年联合国粮农组织统计的数据，全球水稻年种植面积1.6亿公顷，年产量为7.5亿吨，其中90%以上来自亚洲国家（faostat）。在中国，有着悠久的种植历史，截至2020年统计数据，水稻的种植面积和产量仅次于玉米，是中国第二大粮食作物（中国统计年鉴2020年）。然而，水稻病害（包括细菌性、真菌性和病毒性）是限制水稻产量的重要因素之一，关于水稻病害胁迫在世界各地都有报道，特别是在亚洲，如中国、韩国和日本(sy cho et al., 2013; kim et al., 2011; le et al., 2010; yang et al.,2013），这些病害可导致20-70%的产量损失(fahad et al., 2014)。

2、水稻白叶枯病（bacterial leaf blight，blb）是由一种革兰氏阴性细菌（xanthomonas oryzae pv. oryzae (xoo)病原菌引起(lee, chung, kang, chung, &lee, 2016)。病原体最初通过水孔和伤口进入植物，一旦进入维管系统，白叶枯病菌将产生不规则的黄色波浪边缘病变，浸泡直至堵塞木质部筛管，造成水稻苗期萎蔫，在后期可导致叶茎枯萎，最终导致产量下降(shen & ronald, 2002; zhang et al., 2020)

3、快速有效的水稻病害检测和防治是水稻保产的关键。目前，关于水稻病害检测方法：包括常规pcr诊断法(song et al., 2014)，荧光免疫检测法(awaludin et al.,2020)、抗原抗体检测法(ding, liu, wu, zhou, & ni, 2014; wang et al., 2006)、显微观察法(deng, li, jian, ji, & zhou, 2013)、生物接种法（(li, li, dong, wang, &zhou, 2011) )、qrt-pcr(cho et al., 2013; xu et al., 2017)。虽然这些方法可以检测水稻病害，但也存在不足。例如，生物接种法费时费力，显微观察法对设备的依赖较高，且需要经过专门培训的人员。免疫学方法通常需要制备特异的抗体，周期往往较长。qrt-pcr虽然具有高灵敏度和高特异性，但检测设备昂贵，需要专业人员操作。

4、近年来，随着等温扩增技术发展，环介导的等温扩增（lamp）以其灵敏度高、特异性强、速度快、设备要求低等优点在核酸诊断中得到广泛应用(becherer, borst, bakheit,frischmann, & methods, 2020)。lamp 在水稻病害检测中也有报道(le et al., 2010;zhou, du, fan, & zhou, 2012)。使用lamp检测水稻白叶枯病原菌，能在1小时内完成，灵敏度为10 am，但还需设计高特异性的lamp检测引物，方能实现在田间现场对水稻病害的快速准确诊断。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明期望提供基于lamp检测水稻白叶枯病病原菌的引物组及试剂盒，能够以水稻白叶枯病病原菌xoo基因为靶基因，设计并筛选获得能够特异性检测白叶枯病的lamp引物组及检测试剂盒，灵敏度高，特异性强，操作简便，耗时短，成本低，可实现在田间现场水稻病害快速诊断。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、基于lamp检测水稻白叶枯病病原菌的引物组，包括xo1321 lamp引物组或xo2967lamp引物组。

4、进一步地，所述xo1321 lamp引物组包括：正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb，碱基序列如下：

5、fip:5′-tgatggaccagatgcgaagcaacggaaaaggtggcatcgg-3′；

6、bip:5′-agtcatacgccaggttggtcgttgcagacggcgaatgtg-3′；

7、f3:5′-ggctgcagtcacagtgtt-3′；

8、b3:5′-tcgtcgttctcgcatttgg-3′；

9、lf:5′-gcttccagtctgcctggtata-3′；

10、lb:5′-cctgggtgcggtagttgga-3′。

11、进一步地，所述xo2967 lamp引物组包括：正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb，碱基序列如下：

12、fip:5′-agcgcgcagctgatctgccacgaagctgtagcgcaag-3′；

13、bip:5′-atgcgtgtccagctcgcggcgtgccgtactggtcga-3′；

14、f3:5′-cacgccatcggtctgtg-3′；

15、b3:5′-cacggcatgccgttctg-3′；

16、lf:5′-tggggtgttttgtggtattgc-3′；

17、lb:5′-gtgcggcaaacgaaaagcg-3′。

18、这里，本发明以水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzae pv. oryzae pxo99a（xoo）基因为靶基因，设计并筛选获得能够检测白叶枯病的lamp引物组，通过环介导等温扩

19、增法特异性检测水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzae pv. oryzae pxo99a。

20、本发明还另外提供了基于lamp检测水稻白叶枯病病原菌的试剂盒，包含所述的xo1321 lamp引物组和/或xo2967 lamp引物组。

21、进一步地，上述试剂盒包括10 µm fip/bip primer，10 µm lf/lb primer，10 µmf3/b3 primer。

22、这里，10 µm指引物浓度规格：10 µm/µl。

23、进一步地，上述试剂盒还包括10 xthermol buffer，100 mm mgso4，1mm dntp，8000 u bst larger fragment polymerase。

24、进一步地，所述试剂盒的反应体系为25µl，包括2.5µl 10 xthermol buffer，1.5µl 100 mm mgso4，3.5µl 1m mdntp，2µl 10 µm fip/bip primer，1µl 10 µm lf/lbprimer，0.5µl 10 µm f3/b3 primer，1µl 8000 u bst larger fragment polymerase，1µldna模板，超纯水定容至25µl。

25、这里，所述dna模板浓度应不小于20ng/µl，即样本起始投入量至少20ng，所需样本量少，灵敏度高。

26、进一步地，所述试剂盒的检测对象为水稻幼苗或水稻种子提取的核酸样本。

27、进一步地，使用所述试剂盒进行lamp反应，反应条件为65℃孵育40min。

28、进一步地，使用所述试剂盒进行lamp反应，根据反应液颜色变化判断检测结果。

29、这里，使用上述试剂盒进行lamp反应，操作简便，设备要求低，而且耗时短，成本低，结果可视化，实现在田间现场水稻病害快速诊断。

30、本发明有益效果如下：1）本发明方法以水稻白叶枯病病原菌xoo基因为靶基因，设计并筛选获得能够特异性检测白叶枯病的lamp引物组，特异性强；2）本发明方法进一步利用该特异性lamp引物组建立检测水稻白叶枯病病原菌的试剂盒，灵敏度高，设备要求低，而且操作简便，耗时短，成本低，结果可视化，可实现在田间现场水稻病害快速诊断。